大肠杆菌基因组DNA的提取方式文档格式.docx

1、（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65使之溶解，然后室温保存）4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液3、加190ulTE悬浮沉淀，并加10ul10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37保温1小时。5、加30ul5mol/LNaCl,混匀。6、加30ulCTAB/NaCl溶液，混匀，65保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1

2、），5000rmp离心10min8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min10、加500ul70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ulTE中，-20保存。二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。细菌基因组DNA提取试剂盒：1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP302-0250次420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRaDV810A50650元

3、3、Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒GD2411-01BacterialgDNAkit50次423元GD2411-02BacterialgDNAkit250次1798元4、Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒BSC12S150次400元BSC12M1100次750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D3350-00E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit5210元D3350-01E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit50980元D3350-02E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit2003350元荧光定量PCR试验（标准曲线法）定量实验是一种

4、实时实验，用于在聚合酶链反应（PCR）的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列（靶）数量。其中靶可以是DNA、cDNA或RNA。【实验原理】在实时定量实验中，反应是在PCR产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的PCR产物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。在PCR的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。该预定义的PCR循环范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度（与基线循环相对应的Rn值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线。然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度（deltaRnRn值）与

5、阈值交叉的点。Rn值与阈值交叉的分数循环定义为CT。一、试验设计使用StepOne软件中的DesignWizard（设计导向）创建新实验1、定义实验属性在ExperimentProperties（实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型。1）ExperimentName（实验名称）。2）Barcode（条码），然后输入您的PCR反应板上的条码。（可不填）3）UserName（用户名）。4）Comments（注释）。5）选择Quantitation（定量）实验类型6）Next（下一步）2、定义方法和材料在Methods&Materials（方法和材料）屏幕上，选择用于实验的

6、定量方法、试剂、升降温速度和PCR模板。1）将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。用于标准曲线实验的PCR反应包括以下组分：样本其中靶数量未知的样本。标准品数量已知的样本。标准品稀释序列一组用于构建标准曲线的标准品稀释液（例如，1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）。重复数含有相同组分和量的相同反应数。阴性对照含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为“无模板对照（NTC）”。阴性对照应不

7、会扩增。2）为试剂选择TaqManReagents（TaqMan试剂）（包括两个引物一个探针）。如果使用TaqMan试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择TaqManReagents（TaqMan试剂）。TaqMan试剂包括两个引物和一个探针。引物设计用于扩增靶。TaqMan探针设计用于杂交靶，并在扩增靶时产生荧光信号。切记！AppliedBiosystems不建议将TAMRATM染料随StepOneTM系统用作荧光报告基团或淬火基团。如果使用SYBRGreen试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择SYBRGreenReagents（SYBRGreen试剂）。SYBRGreen试剂包括

8、两个引物和SYBRGreen染料。SYBRGreen染料可在结合到双链DNA时产生荧光信号。SYBRGreen染料通常是添加到反应的SYBRGreen母液的一部分。如果使用SYBRGreen染料：选择IncludeMeltCurve（包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。将Standard（标准）选为升降温速度。AppliedBiosystems不提供SYBRGreen试剂的Fast母液。3）为升降温速度选择Standard（2hourstocompletearun）（标准（约两小时完成运行）。如果为PCR反应使用Fast试剂，则选择Fast（40MinutestoCompleteaRun

9、）（快速（约40分钟完成运行）。如果为PCR反应使用标准试剂（包括SYBRGreen试剂和TaqMan试剂），则选择Standard（2HourstoCompleteaRun）（标准（约2小时完成运行）。4）为模板类型选择gDNA（genomicDNA）（gDNA（基因组DNA）。5）Next（下一步）。3、设置靶在Targets（靶）屏幕上，输入您想在PCR反应板中定量的靶数量，然后为每个靶设置检测。1）单击Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinthereactionplate?（您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入1（根据需要填）。注意：靶检测表中的行

10、数将以您输入的数字更新。2）选择SetUpStandards（设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品。建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。SetUpStandards（设置标准品）复选框默认情况下已选取。3）设置靶1检测：a.单击EnterTargetName（输入靶名称）单元格，然后输入RNaseP（示例）。b.从Reporter（报告基团）下拉菜单中，选择FAM（默认）。如果要将FAMTM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5端，则选择FAM。如果要将JOETM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5端，则选择JOE。如果要将VIC染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5端

11、，则选择VIC。如果您正使用SYBRGreen染料以检测双链DNA，则选择SYBR。c.从Quencher（淬火基团）下拉菜单中，选择NFQ-MGB（默认）。如果要将非荧光淬火基团小沟结合物加在您正用于检测靶的TaqMan探针的3端，则选择NFQ-MGB。如果您正使用SYBRGreen染料，则选择None（无）。4）Next4、设置标准品在Standards（标准品）屏幕上，为所有标准曲线输入反应板中的点数和重复数。对于每条标准曲线，输入起始量并选择序列倍数。1）单击Howmanypointsdoyouneedforeachstandardcurve?（每条标准曲线您需要多少个点？）字段，然后

12、输入5。建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。2）单击Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint?（每个点您需要多少次重复反应？）字段，然后输入3。建议每个点三次重复反应。3）为RNaseP（示例）检测定义标准品数量范围：a.单击EnterStartingQuantity（输入起始量）字段，然后输入10000。由于标准品数量的范围会影响扩增效率计算，因此应仔细为您的检测考虑标准品数量的适当范围：为了更准确地测量扩增效率，请使用大范围的标准品数量，扩大到5个至6个对数级之间。如果您为标准品指定大范围的数量，您需使用PCR产物或高度浓缩的模板，如cDNA克隆。如果您

13、的cDNA模板数量有限且/或靶是低拷贝数转录物，或已知在给定范围之内，则可能需要小范围的标准品数量。b.从SelectSerialFactor（选择序列倍数）下列菜单中，选择1:2。序列倍数用于计算标准曲线所有点中的数量。如果您的起始数量是最高数量，则选择如1:3之类的稀释倍数。如果您的起始数量是最低数量，则选择如2X、3X之类的浓缩倍数。4）查看StandardCurvePreview（标准品曲线预览）窗格。标准曲线应包含如下点：10000、5000、2500、1250和625。5、设置样本在Samples（样本）屏幕上，输入反应板中要包括的样本、重复数和阴性对照数，然后选择样本/靶反应以进

14、行设置。1）单击Howmanysamplesdoyouwanttotestinthereactionplate?（您想在反应板中检测多少样本？）字段，然后输入2。（根据需要填）2）单击Howmanyreplicatesdoyouneed?（您需要多少次重复反应？建议对每个样本反应重复三次反应。3）单击Howmanynegativecontrolsdoyouneedforeachtargetassay?（每个靶检测您需要多少阴性对照？），然后输入3。建议对每个靶检测进行三次阴性对照反应。4）4.设置样本1：a.单击EnterSampleName（输入样本名）字段，然后输入pop1（用于重复组1）

15、。b.保留Color（颜色）字段中的默认设置。5）设置样本2：a.单击EnterSampleName（输入样本名）字段，然后输入pop2（用于重复组2）。6）选择AllSample/TargetReactions（所有样本/靶反应）以检测所有样本中的所有靶。选择AllSample/TargetReactions（所有样本/靶反应）以检测所有样本中的所有靶。选择SpecifySample/TargetReactions（指定样本/靶反应）以指定每个样本中要检测的靶。7）在WellCount（反应孔数）窗格中，确认存在：6个未知反应孔U15个标准品反应孔S3个阴性对照反应孔N24个空反应孔8）在V

16、iewPlateLayout（查看检测板布局）选项卡上：a.从ArrangePlateby（反应板布局方式）下拉菜单中，选择Rows（按行）（默认）。b.从PlaceNegativeControls（放置阴性对照）下拉菜单中，选择UpperLeft（左上角）（默认）。9）Next6、设置运行方式在RunMethod（运行方法）屏幕上，查看默认运行方法的反应体积和温度变化过程设置。若需要，您可调整默认运行方法或用RunMethod（运行方法）库中的某种方法进行替换。1）单击选择GraphicalView（图形视图）选项卡（默认）或TabularView（表格视图）选项卡。2）单击Reaction

17、VolumePerWell（每个反应孔的反应体积）字段，然后输入25L。为“反应体积/反应孔”输入介于10至30的值。StepOne系统支持10至30L之间的反应体积。3）确保温度变化过程设置显示保持和循环阶段。确保温度变化过程设置适合试剂。如果正执行一步法RT-PCR扩增，则包括一个反转录步骤。如果实验需要一个不同的温度变化过程设置，调整温度变化过程设置或用RunMethod（运行方法）库中的某个温度变化过程设置进行替换。RunMethod（运行方法）库包括在StepOne软件中。7、查看反应设置在ReactionSetup（反应设置）屏幕上，选择检测类型（如果使用TaqMan试剂），然后查

18、看为准备PCR反应、标准稀释序列和样本稀释而计算的剂量。若需要，您可调整反应体积、额外反应体积、组分浓度、标准品浓度和/或稀释后样本浓度。对反应板中的每个靶检测执行这些步骤。完成ReactionMixCalculations（反应预混液计算）选项卡1）选择ReactionMixCalculations（反应预混液计算）选项卡（默认）。2）从SelectTarget（选择靶）窗格中，选择RNaseP。3）从AssayType（检测类型）下拉菜单中，选择Inventoried/MadetoOrder（库存/定制）。如果正使用TaqMan试剂，选择所使用的检测类型：如果正使用AppliedBiosy

19、stemsTaqManGeneExpressionAssays（库存/定制）或AppliedBiosystemsCustomTaqManGeneExpressionAssays，则选择Inventoried/MadetoOrder（库存/定制）。如果正使用PrimerExpress软件设计检测，则选择Custom（定制）。4）确认ReactionVolumePerWell（每个反应孔的反应体积）字段中显示255）确认ExcessReactionVolume（额外反应体积）字段中显示10%。包括额外反应体积以弥补移液过程中的损失。建议至少准备10%的额外反应体积。6）在ReactionsforR

20、NaseP（RNaseP反应）窗格中：a.确认MasterMixConcentration（母液浓度）字段中显示2.0X。b.确认AssayMixConcentration（检测预混液浓度）字段中显示20.0X。c.查看PCR反应的组分和计算的剂量。7）在StandardDilutionSeriesforRNaseP（RNaseP的标准品稀释序列）窗格中：a.单击StandardConcentrationinStock（储液中标准品的浓度）字段，然后输入20000。b.单击units（单位）字段，然后输入copiesperc.查看为准备标准品稀释序列计算的剂量。完成SampleDilution

21、Calculations（样本稀释计算）选项卡1）选择SampleDilutionCalculations（样本稀释计算）选项卡。2）单击DilutedSampleConcentration（10XforReactionMix）（稀释后样本浓度）（对于反应预混液为10X），然后输入6.6。3）从单位下拉菜单中，选择ng/L（默认）。4）查看为样本稀释计算的剂量。8、实验材料订购在MaterialsList（材料列表）屏幕上，查看建议用于准备PCR反应板的材料列表。或者，您可从AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems产品仓库）订购所建议的材料。创建购物篮，

22、向购物列表中添加项目，然后登录以提交您的订单。您必须具有不受限制的网络连接才能访问AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems产品仓库）。1）在AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems产品仓库）网站上查找靶检测套件：a.确保您的计算机已连接到因特网。b.单击EnterGeneName（输入基因名）字段，输入RNaseP，然后单击FindAssay（查找检测套件）。c.在FindAssayResults（发现检测套件结果）对话框中，选择您的检测套件。d.单击ApplyAssaySelection（应用检测套件选择）。2）

23、完成ExperimentMaterialsList（实验材料列表）窗格：a.从Display（显示）下拉菜单中，选择AllItems（所有项）（默认），然后查看建议的材料。若需要，使用右侧的滚动条查看所有项。3）用于进行定量实验的Inventoried/MadetoOrder检测设计用于配合以下TaqMan母液使用：FastUniversalPCRMasterMix（2）,NoAmpEraseUNG，250次反应，编号43520422UniversalPCRMasterMix，200次反应，编号43044372UniversalPCRMasterMix，2000次反应，编号432670810包

24、装TaqMan2UniversalPCRMasterMix，编号43057192UniversalPCRMasterMix,NoAmpEraseUNG，200次反应，编号43240182000次反应，编号43266142UniversalPCRMasterMix，NoAmpEraseUNG，编号43240204）靶DNA或cDNA有几种TaqMan和SYBRGreen试剂可用于定量实验。a.TaqMan试剂FastUniversalPCRMasterMix（2）,NoAmpEraseUNG，250次反应43520422UniversalPCRMasterMix,No，AmpEraseUNG，2

25、000次反应，编号4326614编号4324020PCRCoreReagentsKit，200次反应，编号N808-0228b.SYBRGreen试剂PowerSYBRGreenPCRMasterMix（1mL），40次反应，编号4368577GreenPCRMasterMix（5-mL），200次反应，编号4367659GreenPCRMasterMix（105-mL），2000次反应，编号4368708GreenPCRMasterMix（50mL），2000次反应，编号4367660SYBRGreenPCRMasterMix（1-mL），40次反应，编号4344463GreenPCRMasterMix（5-mL），200次反应，编号4309155GreenPCRMasterMix（50-mL），2000次反应，编号4334973GreenPCRCoreReagents，200次反应，编号43048869、完成设计向导要完成DesignWizard（设计向导）工作流程，查看反应板布局，然后选择一个退出选项。1）在ReviewPlateforExperiment（查看实验的反应板）窗口中，查看反应板布局。2）单击SaveExperiment（保存实验）