化学发光分析法测定黑米色素抗氧化作用精Word文档下载推荐.docx

1、本实验用化学发光分析方法来评价黑米色素抗活性氧的能力,旨为黑米的科学应用提供实验依据。1试剂、仪器、样品及色素的提取缓冲溶液为无酚红的pH7.4的H ank s平衡盐溶液（HB SS。酵母多糖（sigm a产品称取30m g酵母多糖悬于3mL生理盐水中,水浴煮沸30m in后离心,弃去上清液,沉淀再悬于HB SS缓冲溶液中,终质量浓度为5g L,4保存。鲁米诺（M erck2Schuch rat产品称819m g 鲁米诺,加入0120mL二甲基亚砜溶解后,加pH7.4的H ank s应用液50mL,电磁搅拌5h。终浓度为1mm o l L,冰箱保存。D G3030发光光度计（南京华东电子管厂。

2、黑米（紫香米由广东省农科院提供。黑米色素的提取:400g黑米加入70%乙醇1200mL,室温浸泡,24h后过滤。滤渣加70%乙醇再浸泡24h,过滤。合并二次滤液,减压浓缩,得黑米粗色素提取物。黑米粗色素提取物硅胶柱层析,先用氯仿:95%乙醇=28洗脱液洗脱,得黑米色素A收集液;然后改用75%乙醇洗脱,得黑米色素B收集液。黑米色素A、B 两收集液经减压浓缩,真空干燥得黑米色素A 和黑米色素B。A、B两样品经定性分析与文献2相似,为黄酮花色苷类化合物。2实验方法211样品对全血化学发光抑制作用的测定在文献3的基础上改进选用W istar大鼠,后双脚注射3%甲醛011mL。12h后双脚水肿,眼部取血

3、,肝素抗凝。然后立即按血液HB SS液收稿日期:1998209211资金来源:国家自然科学基金资助项目,N o.39060028;广西教育厅科研项目,N o.9733作者简介:龙盛京（1957-,男,副教授67=18比例稀释,混匀,4冰箱保存备用。用时取019mL稀释血,加入不同量的供试液（空白不加,然后加入鲁米诺50L,37恒温水浴箱中衡温10m in后,加入酵母多糖100L,记时,混匀。置于37恒温水浴箱中保温到10m in时测定发光强度。每次延时O s,测定60s,积分60s,仪器放大倍数1103。完成后仪器自动打印出发光强度积分值。212样品清除羟基自由基（OH的测定方法参考文献4的方

4、法略加改进原用50mm o l L磷酸钠缓冲液配制的试剂都改由二次蒸馏水配。所用试剂和样品均放在37恒温水浴箱中保温,在测定管中加入浓度为118mm o l L的维生素012mL,浓度为118mm o l L的硫酸铜014mL,质量浓度为500g L的酵母012mL,浓度为0.2m o l L pH6.2的磷酸钠缓冲溶液016mL,混匀,加入不同量的供试液（空白不加,混匀,置于发光仪中,于37加入浓度为60mm o l L的双氧水016mL,启动反应后,测定10s内发光强度的总值。样品清除过氧化氢的测定方法参照文献5的方法。样品清除超氧阴离子自由基的测定方法按文献6的方法。3结果与讨论样品的抗

5、氧化作用大小用清除率或抑制率以及抗氧化值表示。每种方法每个样品平行做3次,取平均值,按下式计算清除率或抑制率:清除率或抑制率（%=（空白值-样品值 空白值100%液体C I50、固体C I50、抗氧化值的计算:液体C I50和固体C I50为从量效关系曲线回归方程推出的,当清除率为50%时所需的样品毫升数或样品毫克数。抗氧化值（AOV=（S测-S标 S标S测=固体C I50（m g,S标=维生素C固体C I50或硫脲固体C I50。以维生素C为标准的抗氧化值（或以硫脲为标准的抗氧化值规定维生素C的AOV为零。当AOV为负值时,该样品抗氧化能力就比维生素C强,如AOV为正值,则抗氧化能力就越弱。

6、311黑米色素对全血化学发光的抑制作用由表1可见,黑米色素A、B两样品对全血化学发光有较强的抑制作用并呈量效关系。从AOV的数据比较,两样品抑制全血化学发光的作用与维生素C相当。揭示它们对细胞体系产生的活性氧有较强的清除作用。312黑米色素对过氧化氢的清除作用黑米色素A、B两样品对过氧化氢都有较强的清除作用,其中黑米色素B的AOV为负数,表明黑米色素B清除过氧化氢的能力比维生素C强,结果见表2。表1黑米色素对全血发光的抑制作用Table1I nh ibitory effects of the p ig m en t fro m black r ice on che m ilu m i nesc

7、ence i n whole blood样品浓度（g L抑制率（%（XSD10L50L（用量100LC I50原液（L固体（m gAOV黑米色素A515173518558180417369137115340*010977黑米色素B530109319758188019292181111838112011906010431维生素C5181415121531252176781981138361540118270100表2黑米色素对过氧化氢的清除作用Table2Percen t ages of H2O2scavenged by the p ig m en t fro m black r ice清除率（

8、%（X1L5L黑米色素A53316121195711011197919921963198801019940186141黑米色素B55018031947216311828712111750199320100496-0153641L3L5L维生素C514125114962124118194107012821142301010701000313黑米色素对超氧阴离子自由基（O-2的清除作用黑米色素对O-2都有一定的清除能力,但是两黑米色素清除O-2的AOV数据都大于30,这表明对O-2的清除能力比维生素C要小30倍左右,结果见表3。314黑米色素清除羟基自由基的作用由表4可见,黑米色素A、B两样品对O

9、H有一定的清除作用,其中黑米色素B的清除能力强于黑米色素A,但两者对OH的清除作用都小于硫脲。表3黑米色素清除超氧阴离子自由基的作用Table3Percen t ages of O-2scavenged by the p ig m en t fro m black r ice100L200L黑米色素A520186116438138314774103111610714501537234121黑米色素B51L 2812531473L5118901707419011719511301475630117维生素C51418331225113911288111801243105010150100表4黑米色

10、素清除超羟基自由基的作用Table4Percen t ages ofOH by scavenged by the p ig m en t fro m black r ice500L1000L1500L黑米色素A5301095100491101151641763129105812351291121581黑米色素B549106314210L 651204132771171103526178216345176硫脲513122419940181313555133112757719201390100全血中的白细胞受到酵母多糖的刺激后,产生免疫反应,通过已糖磷酸支路代谢途径的8活化,发生呼吸暴发,产生活性

11、氧,并伴随发光现象。但这种发光现象非常弱,需要高灵敏度的仪器才能检测到。如果在细胞吞噬的过程中加入冷光剂鲁米诺,则发光强度明显增强,这是由于细胞吞噬过程中所产生的活性氧把鲁米诺氧化成激发态分子,被激发的鲁米诺退激回基态时产生波长为425nm的化学发光。A llen和Kato在此基础上先后建立了以全血为材料检测呈噬细胞化学发光的方法。其结果表明,全血化学发光与细胞吞噬氧化功能成正比,与吞噬过程产生的活性氧浓度成正比7,8。在全血化学发光体系中加入的样品如能消除活性氧,则全血化学发光强度就会减弱,由此可根据样品抑制全血化学发光的强弱来衡量其清除由细胞体系产生的活性氧能力的大小。黑米色素对全血化学发

12、光的抑制作用较大,这揭示黑米色素对细胞体系产生的活性氧有较大的清除能力。黑米色素为黄酮花色苷类化合物,其分子结构中有酚羟基存在,黑色素对细胞体系或非细胞体系产生的活性氧都有一定的清除作用,这与酚羟基的存在有关。酚羟基是一类较为活泼的官能团之一,易被活性氧氧化,而表现出较强的抗活性氧化的能力。结果提示,黑米的食疗功能与黑米色素的抗活性氧能力有关,黑米色素是食品中较好的自由基清除剂之一。黑米色素在体内代谢过程中的抗氧化作用如何有待进一步研究。参考文献1Singh A,Smoak B L,Patterson K Y et al.Am JC lin nutr.1991,53:1262赖来展1黑色食品的

13、研究与加工技术1北京:中国农业科技出版社,1997,1063徐孝仪,程松高1中国免疫学杂志,1986,2（1:344陈季武,胡天喜1生物化学与生物物理进展,1992,19（2:1365龙盛京,钱莹1营养学报,1997,19（4:4706龙盛京,李毅1中国药理学通报,1994,10（1:517A llam P C,L oo se L D.B i ochem bi ophys R esCommon,1978,69:2458Kato T,W okalek H,Schopf E.K li mW ochensch r,1981,59（5:203D eter m i na tion of An tiox

14、ida tion of P igm en t from Black R ice by Che m ilu m i nescence L ON G S heng2j ing （D ep artm en t of Chem istry,Guangx i M edical U n iversity,N ann ing530021,Fenx i Sh iyan sh i,1999,18（4:7679T he inh ib ito ry effect of p igm en t from b lack rice on active oxygen w as studied by u sing chem i

15、lum inescence.T he inh ib iti on on chem inescence in w ho le b lood and the scavenging effects on p erox ide an i on radicals, hydroxyl radical and hydrogen perox ide w ere m easu red.T he resu lts show ed that the p igm en t from b lack rice m arkdly inh ib it chem ilum inescence in w ho le b lood

16、,and scavenge the active oxygen p roduced by non2 cellu lar system s to a certain ex ten t.T hese resu lts suggest that the b lack rice has the funceti on of dietetic therap y,and the p igm en t from b lack rice is one of the better free radical scavengers in b lack food.KeywordsB lack rice;p igm en t; chem ilum inescence an ti ox idati on;active oxygen9