专题五DNA和蛋白质技术文档格式.docx

1、大多数蛋白质不能忍受6080oC的高温，而DNA在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。3）DNA的鉴定 在 条件下，DNA遇 会被染成 色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。2实验设计1）实验材料的选取 凡是含有 的生物材料都可以考虑，但是使用 的生物组织，成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌哺乳动物的红细胞的特点？2）破碎细胞，获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的 ，同时用 搅拌，过滤后收集滤液即可

2、。如果实验材料是植物细胞，需要先用 溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的 和 ，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？3）去除滤液中的杂质 阅读课本的三个方案，为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？方案二与方案三的原理有什么不同？4）DNA的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积 、冷却的 ，静置 ，溶液中会出现 ，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒 搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml

3、的试管，各加入物质的量浓度为 的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的 。混合均匀后，将试管置于 中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变 。3操作提示以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g ，防止 。加入洗涤剂后，动作要 、 ，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要 ，以免 ，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。二苯胺试剂要 ，否则会影响鉴定的效果。4结果分析与评价疑难点拨1 DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液

4、浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。2 制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清液血浆。3提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测

5、的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。4在DNA的析出的步骤中用到玻璃棒搅拌时，注意动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。5盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这

6、样可以减少提取过程的DNA的损失。典例解析本实验中有三次过滤：过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次过滤分别为了获得（ ）A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液C含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNAD含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液答案：A解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理，方能得到较纯的D

7、NA。DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。【课本问题答案和提示】（一）旁栏思考题1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。2加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致

8、看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。5为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。6方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。（二）练习1答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DN

9、A含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；2答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。课堂演练一、选择题（10个）1.在研究DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是（ D ）A.除去血浆中的蛋白质 B.除去染色体上的蛋白质 C.除去血细胞表面的蛋白质D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使DN

10、A释放，便于进一步提纯2与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（ C ）A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L3洗涤剂能够瓦解（ B ），但对DNA没有影响。A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D.细胞质4在沸水浴的条件下，DNA遇（ D ）会被染成蓝色。A.斐林试剂 B.苏丹染液 C.双缩脲试剂 D.二苯胺5在DNA提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（ B ）A.不易破碎 B.减少提取过程中D

11、NA的损失 C.增加DNA的含量 D.容易洗刷6下列操作中，对DNA的提取量影响最小的是（ B ）A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质B.搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌C.在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌7DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（ D ），静置23min，溶液中会出现白色丝状物。A.09%的NaCl B.0.14mol/L的NaCl溶液 C.质量分数15%的HCl D.体积分数为95%的酒精溶液8.以血液为实验

12、材料时，需要向血液中加入（ C ），防止血液凝固。A.醋酸钠 B.龙胆紫 C.柠檬酸钠 D.醋酸洋红9.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ C ）A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出10.去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（ C ）分解蛋白质。A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.肠肽酶二、非选择题（3个）1提取鸡血中DNA时，要除去血液中的上清液，这是因为什么？因为上清液是血浆，不含有血细胞，DNA存在于沉郁试管底部的鸡血细胞的细胞核中，所以提取鸡

13、血中的DNA时，要除去血液中的上清液。2填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。提取鸡血细胞中核物质 溶解核内DNA： 析出2mol/LNaCl溶液中的DNA DNA粘稠物的再溶解 提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物 DNA的鉴定 蒸馏水2mol/LNaCl溶液蒸馏水2mol/LNaCl溶液冷却的95%的酒精二苯胺3.关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：鸡血细胞中红细胞 ，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中 细胞树木较多，可以提供丰富的 。实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是 生活在

14、牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是 ，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中 ，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为 。若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加 程序，使组织细胞更易分离。含细胞核；红；DNA 鸡血细胞液中DNA相对含量很难提取到DNA；无细胞核；肝细胞有细胞核研磨【知识拓展】1.二苯胺鉴定DNA的化学原理DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色（溶液呈浅蓝色）。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。2.研磨液中几种药品的作用Tris/HCl:提供缓冲体系，

15、DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离。【教学反思】课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。PCR的原理和PCR的基本操作。PCR的原理。1PCR原理填写下列表格参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链合成子链的原料DNA聚合酶引物DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为 ，而

16、磷酸基团的末端称为 。DNA聚合酶不能 开始合成DNA，而只能 ，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是 。在DNA的复制过程中，复制的前提是 。在体外可通过控制 来实现。在 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为 。PCR利用了DNA的 原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来 的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供： ， ， ， ，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。2PCR的反应过程PCR一般要经历 循环，每次循环可以分为 、 和 三步。从第二轮循

17、环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由 延伸而成的DNA单链会与 结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能 ，使这段固定长度的序列成指数扩增。3实验操作在实验室中，做PCR通常使用 ，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在 中依次加入各组分，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。4操作提示为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的 、 、 以及蒸馏水等在使用前必须进行 。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时，移液管上的枪头要 。1.PCR技术

18、简介PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。2细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用解旋酶：打开DNA双链 DNA母链：提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 引物：使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为2030

19、个核苷酸）3DNA的合成方向DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。4PCR的反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到90oC以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在

20、DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。5PCR技术与DNA的复制PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。（230）典

21、例解析一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，利用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的（ ）A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25C解析：一个DNA分子利用PCR技术循环5次后产生的DNA分子数目为2n。而DNA的复制是半保留复制，其特点是：新形成的DNA双链，一条是来自亲代DNA分子的母链，另一条是新形成的子链。这样最初由15N标记的DNA分子复制后，其标记的两条链就分别进入两个子代DNA分子中，这样两个子代DNA分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培养，不论经过多少次复制，最初标记的两条链始终存在于两个DNA分子中，这样经过n次循环后，标记的DNA分子中2

22、/2n,即1/2n-1。练习1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（2n=230=1 073 741 824）。2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考分子克隆实验指南（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。【课堂演练】一选择题（10个）1DNA分子复制时，解旋的两条链中（ C ）A仅一条作为复制模板 B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来

23、的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（ D ）互补碱基对之间氢键断裂互补碱基对之间形成氢键DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对子链与母链盘旋成双螺旋状结构A B C D3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（ A ）DNA复制RNA复制转录翻译逆转录A B C D4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（ D ）酶游离的脱氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA适宜的温度适宜的酸碱度A B C D5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代

24、脱氧核苷酸的长链？（ A ）A 2 B 4 C 8 D 16，6.关于DNA分子的叙述中，正确的是（ C ）A .DNA的两条链是极性相同，同向平行 B.DNA的两条链是极性相同，反向平行C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的 D.DNA的两条链是极性不同，同向平行7.假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（ B ）A 215 B 230 C 260 D 2318.DNA的合成方向总是（ C ）延伸。A从DNA分子的左端向右端 B从DNA分子的右端向左端C从子链的5，端向3，端 D从子链的3，端向5，端9.要使PCR反应在体外

25、的条件下顺利地进行，需要严格的控制（ C ）A 氧气的浓度 B酸碱度 C温度 D 大气的湿度10.DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（ ）A模板母链相同 B非模板母链相同 C两条模板母链相同 D两条模板母链都不相同二非选择题（2个）1PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是：在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的D

26、NA片段处，还需要 、和 、 等条件。某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次（即复制三次）至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是 和 个。DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对四种脱氧核苷酸、能量、酶 245、3152将大肠杆菌置于含15N的培养基上培养。这样，后代大肠杆菌细胞中的DNA双链均被15N标记。然后将被15N标记的大肠杆菌作为亲代转到普通培养基中，繁殖两代。亲代、第一代、第二代大肠杆菌DNA的状况如图所示。第一代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息与亲代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息完全相同的原因是 。如果将第二代大肠杆菌的DN

27、A分子总量作为整体1，其中，带有15N的第二代大肠杆菌DNA分子约占总量的 %。如果将第二代大肠杆菌的DNA含量作为整体1，其中含15N标记的第二代大肠杆菌的DNA含量（脱氧核苷酸单链）约占总量的 %它们均是以亲代15N标记的DNA双链的每条链为模板，通过碱基互补配对原则合成的50 25【参考资料】1.琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系凝胶浓度要依据DNA分子的大小来确定。编码双歧杆菌16srRNA的DNA片段大小约为1 500个核苷酸的长度，因此根据表4-1选用1（1 g/100 mL，下同）的凝胶浓度。表4-1琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系琼脂糖凝胶浓度（%）线型DNA分子的分离范围（千碱基对，kb） 0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.122.核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有