张雅 110010 微生物及生物工程制药讲义文档格式.docx

1、 随着生物化学、细胞生物学、应用分子生物学、遗传工程和代谢工程的发展和各种新的生物技术的应用，由微生物产生的除抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质的报道日益增多。微生物制药技术作为一项新兴的技术，在世界各国卫生医疗、环境保护等领域已经取得了卓越的成绩，现代社会以追求绿色高科技，可持续发展为目标，随着能源日益稀缺传统医药发展瓶颈日趋严重，微生物制药将在医疗领域发挥重大作用。如一些生物制品，抗生素，干扰素，甾体激素等微生物制药技术成熟发展的产物，在微生物制药领域中，占据着重要的作用。同时，微生物的转化在药物研制中的一系列突破性的应用给医药工业创造了巨大的医疗价值和经济效益。新型微生物技术药物己成为

2、全球的热点2。1 微生物药物的概念及特点 微生物药品是指运用微生物学、医学、生物化学等的研究成果，从微生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的3。近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特

3、点。2 微生物及生物制药的研究进展2.1微生物发酵制药技术 发酵是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。1 8 9 7年，德国的毕希纳进一步发现了酶在发酵中的作用，人们开始了解发酵现象的本质。20世纪40年代，弗洛里和钱恩与许多的科学家合作， 研究出了大规模生产青霉素的方法，使青霉素的生产实现了产业化。从 20世纪50年代起，氨基酸发酵工业、酶制剂工业、多糖和维生素发酵工业相继诞生4。微生物发酵技术广泛的应用到制药行业。用微生物发酵的方法制药。就是用很大的容器培养可以大量产生某种药的微物，控制温度和营养成分，让微生物大量繁殖并产生需要的药物。比如青

4、霉素就是大量培养青霉菌。大部分抗生素都是这样生产。也有一些生物制药是菌（例如大肠杆菌）中转入可以制造人类所需的一些蛋白质或药物的遗传编码。通过培养这种细菌来大量得到我们所需的药物5。我们现在使用的抗生素就是一些细菌和放线菌代谢产物。2.2干扰素的研究进展 自Issacaa等于1957年发现干扰素 （ Interferon,IFN） X来，已经证明不论高等动物还是低等动物都有干扰素类似物质产生。干扰素具有抵抗病毒感染 、抑制肿瘤细胞生长与调节机体免疫功能的作用6 ，因此成为当今免疫学、遗 传学、病毒学、肿瘤学和分子生物学研究最为活跃的领域之一。近年来，随着研 究的深入进展。IFN在一 些畜禽病毒

5、性疾病及肿瘤性疾病的治疗方面取得了显著的疗效，科研工作者越来越重视干扰素的基因结构、作用机理、基因工程等方面的研究 。 干扰素（ interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性糖蛋白，具有广泛的抗病毒 抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。现已临床用于人类流行感冒、带状疱疹、乙型肝炎和癌症治疗，如骨瘤、乳癌等。早期，干扰素是用病毒诱导人白细胞产生的，产量低，价格高。现在可利用基因工程技术在大肠杆菌和粮酒酵母中表达，工业发酵生产。慢性乙型肝炎治疗的总体目标是: 最大限度地长期抑制乙型肝炎病毒（ HBV） ，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化、原发性肝

6、细胞癌（ HCC） 及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间，干扰素仍是抗乙型肝炎病毒治疗的重要药物之一7。 目前可供临床选用的干扰素种类很多。例如国产重组 IFN1型和IFN2型，进口的干扰能（IFN2b）、罗扰素（IFN2a）、惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）及组合干扰素等等。各种亚型的干扰素-（含1或2或2a或2b）疗效近似；干扰素-（IFN）也有相似效果，但它在肌肉组织中易被灭活。干扰素-制剂进入血液后，稳定性差，确切疗效尚在观察中，但可作为干扰素- 的替代制剂。当前国内对干扰素-各亚型制剂的活用较佳剂量为（35）X106单位/日，连续用1 周后改为隔日或每周3次，肌内注射，疗程3

7、6月8。 HBV 感染呈世界性流行，但不同地区的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约 亿曾感染过 HBV，其中3.5亿例为慢性 HBV 感染者，每年约有 100 万例死于 HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化和 HCC: 2006 年全国乙型肝炎流行病学调查表明，我国159 岁一般人群 HBSAG携带率为7.18%，5岁以下儿童的 HBSAG 仅为 0.96%。据此推算，我国现有的慢性 HBV感染者约 9300万例，其中慢性乙型肝炎患者约 2000万例。 干扰素的抗肿瘤作用。在型和干扰素中，INF、IFN-对急性肿瘤的治疗不如INF- 有效INF-抗肿瘤作用最强，对肿瘤细胞有直接的抗增生作

8、用 。可通过延长细胞周期以延缓肿瘤细胞的生长和繁殖。还可通过抑制癌基因的表达来阻止或减慢肿瘤细胞的转化过程：能激活巨噬细胞 、NK细胞等以直接杀伤癌细胞或间接抑制癌基因；可诱导肿瘤坏死因子并促进癌细胞对T NF-受体、MHC-类抗原等的表达，使其易被杀伤性 T淋巴细胞识别而被杀伤 。研究者已将INF - 基因借助逆转录病毒载体转移入肿瘤细胞 ，使肿瘤细胞自行分泌 INF ，发挥杀瘤效应 。IFN能增强巨噬细胞及NK细胞的杀伤性。增加细胞表面抗原和受体的表达。抑制B细胞的功能9 。从而降低肿瘤细胞表面封闭抗体的水平。 干扰素的免疫调节功能。干扰素具有很强的免疫调节作用.可调节T、B淋巴细胞的免疫

9、功能。小剂量起促进作用。大剂量起抑制作用。另外，还能影响抗原提呈作用，如 I NF- 能显著增加抗原提呈细胞表达 MHC-类抗原的数量。增强抗原提呈细胞与T细胞的相互作用 。增加辅助T细胞的数量并增强迟发性超敏反应。I F N具有巨噬细胞活化因子的作用。能引发巨噬细胞的杀肿瘤效应。I NF-是细胞介导的免疫应答中关键的成分。已有证据表明INF-可能是移植排斥过程中极为重要的分子。IFN能增强细胞毒 T细胞和自然杀伤细胞杀伤靶细胞的能力，能诱导细胞表达 I L -2（ 白介素 ）受体 ，从而促进T细胞增殖。进一步扩大免疫应答INF-对抑制性T细胞的作用有双向INF-抑制TH细胞的增殖和产生IL

10、-4、IL-1 0等细胞因子。这种抑制作用能改变免疫应的类型和产生抗体的类型INF能诱导人B细胞的增殖和分化与IL -2协同增加轻链合成，I NF-对B细胞的促增殖作用可能有其他因素介导 。因为完全纯化的B细胞对I NF- 无反应。小鼠B细胞产生IgG2ot抗体需INF-B细胞产生IgG2o t抗体需要INF -辅助，而产生IgG3抗体对INF-依赖性较低。INF -能诱导补体C3b受体表达。但抑制该受体与C3b的结合辅助 ，而产生IgG3抗体对INF -依赖性较低。INF-能诱导补体C3b受体表达。但抑制该受体与C3b的结合10。 目前用于临床的干扰素有自然干扰素：人体淋巴母细胞样多亚型天然

11、干扰素（IFN-N1），葛兰素威康公司（英国）生产，商品名为惠福仁。人体白细胞重组干扰素IFN1b：世界上第一个采用中国人干扰素基因克隆和表达的IFN1b型干扰素，商品名为赛若金，深圳科兴生物制品有限公司生产，有300万U/支和500万U/支两种剂量，为粉剂。IFN-2a：罗氏公司（瑞士）生产的干扰素，有300万U/支和450万U/支两种剂量，粉剂和水剂两种剂型；沈阳三生公司生产的因特芬，每支300万U；辽宁卫星生物研究所生产的迪恩安，每支300万U和500万U两种剂型，均为粉剂，但备有专用溶解液。IFN2b：先灵葆雅（美国）公司生产的干扰能300万U/支和500万U/支，均为粉剂；天津华立达

12、公司生产的安福隆，300万U/支，粉剂；安徽安科公司生产的安达芬，100万U/支。300万U/支、500万U/支粉剂。复合干扰素安进公司（美国）生产的复合干扰素C-IFN，商品名为干复津。其为针对治疗目的而设计的一种非人体能自然产生的生物合成干扰素。干复津的特异活性被定位每毫克蛋白质功能单位，在体外已证实其活性至少比2a或2b干扰素高出5倍，干复津所用的微克是质量测量单位，而其他干扰素所用的国际单位U是活性测量单位。干复津有9g、15g两种剂量的剂型。其9g的疗效与300万U的IFN-2b相似11。2.3基因工程制药研究进展 1953年Waston和Crick发现遗传物质DNA的双螺旋结构,给

13、整个生物学乃至整个人类社会带来了一场革命。此后,一系列有关遗传信息即基因研究的成果很快地向应用和开发拓展。1973年Cohen等首次实现体外基因转移,1977年Boyer首次获得生长激素抑制因子的克隆,1982年第一个基因工程重组产品人胰岛素被批准应用。迄今为止,已有50多种基因工程药物上市,近千种处于研发状态12。基因工程药物已形成一个巨大的高新技术产业,产生了不可估量的社会效益和经济效益。 基因工程（gene engineering）,又称重组DNA技术（recombinant DNA technique）,就是将重组对象的基因插入载体,拼接后转入新的宿主细胞,构建成工程菌（或细胞）,实现

14、遗传物质的重新组合,并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术,产生出人类需要的基因产物,或者改良、创造出新的物种造福于人类。用基因工程可以打破不同物种在亿万年中形成的天然屏障,任何不同种类生物的基因都有可能通过基因工程技术而组合到一起13。自20世纪70年代基因工程诞生以来,最先应用且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。目前世界上70%的生物技术公司从事医药产品的开发。基因工程开创制药工业新门类。生产基因工程药物的基本方法是:将目的基因连接在载体上,然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞）,使目的基因在靶细胞中得到表达,最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂,从而成为蛋白类

15、药或疫苗14。若目的基因直接在人体组织靶细胞内表达,就成为基因治疗。利用基因工程技术生产药品的优点在于:大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽;挖掘更多的生理活性物质和多肽;改造内源生理活性物质;可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。 DNA重组技术不仅直接提供干扰素、白细胞素、红细胞生成素（EPO）、集落刺激因子（GM-CSF）等基因工程药物,供临床治疗使用,提高对恶性肿瘤、心脑血管病、重要传染病和遗传病的防治水平15,而且也广泛应用于改造已有的抗生素和生物制品等传统医药工业。 基因工程药物具有特异性强、毒性小、作用机理清楚、活性高等特点,但仍存在半衰期短、易影响体内环境稳定状态、稳定性差、

16、不宜口服等缺点。为了克服这些缺点,需研究更合适的表达载体,对有效成分进行修饰和改构,提高药物分子的稳定性,研究靶向、缓释等药物剂型,限制作用部位与作用浓度以减轻副作用,改进生产及纯化方法,研究药物配伍疗法等。更重要的是发挥基因工程的研究作用,促进合理药物设计16。我国的基因工程制药与国外水平有一定差距,而且基因工程制药投资很大,笔者认为基因工程制药特别是产业化,应根据我国的国情,选择重点,且不可一哄而上,通过不懈努力,相信基因工程制药在我国国民经济发展中必起到重要作用17。 目前已上市的约20种基因工程药物、逐步进入临床试验阶段的约150种新的基因工程重组蛋白质药物或疫苗和40种单克隆抗体,都

17、是大分子蛋白质。在基因工程发展之前,这些药物不是根本不可能获得,就是不能得到足够大的量,或者得不到足以作为治疗药物使用的纯度要求。在进行临床试验的基因工程药物中,半数以上针对癌症或癌症相关的疾病。疫苗研究的重点是抗艾滋病和抗肝炎疫苗18。无论是新的生物技术公司还是老的大公司都参与了这些产品的研究和开发。表1列出已经批准或正在审批的部分基因工程药物。生物工程药物研究和开发有两个导向,即市场导向和技术导向。其中较多的是市场导向,如促红细胞生成素（EPO）、人生长激素（hGH）、胰岛素、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）和重组乙肝疫苗就是这一类型,都是性能好、需要量大的新药。技术导向型市场机会不够确定,

18、如A-干扰素（IFN-A）因有抗病毒作用,所以用来治疗各种由病毒引起的疾病,在基因工程技术产生之前,是不易分离出足以进行确定其生物活性和可能的治疗效果的天然IFN-A的,IL-2是作用尚有不明之处的一种天然免疫系统蛋白质,但用以治疗癌症可能有效。这类药物市场与药物作用都没有充分确定,最终上市成功与否尚难预测19。 基因工程产品的种类可分为重组传递蛋白、重组结构蛋白和重组修饰蛋白。重组传递蛋白又分为三类,即影响免疫系统的、介导组织修复的和纠正代谢缺失或改变代谢的。基因工程产品中最有希望的是影响免疫系统的传递蛋白。集落刺激因子（CSF）是离体条件下免疫系统祖细胞（一种造血细胞）增生和分化所需的一组

19、糖蛋白这些因子对获得性与先天性骨髓衰竭症包括癌症、重度烧伤与艾滋病具有治疗作用。用于治疗骨髓移植衰竭的粒细胞巨噬细胞-CSF（GM-CSF）和治疗化疗后嗜中性白细胞减少症的粒细胞-CSF（G-CSF）已于1991年分别被批上市。干扰素（IFN）是另一类免疫调节剂,IFN-A2a,IFN-A2b和IFN-C1b均已获批准。IL-2作为免疫调节剂用以治疗转移性肾细胞癌于1992年批准。有希望的领域。EPO是肾脏产生的能刺激红细胞成熟的传递蛋白,治疗慢性肾衰贫血和艾滋病人药物治疗后贫血的EPO已于1990年以前被批准上市。具有创伤修复作用的几种生长因子蛋白如表皮生长因子（EGF）、血小板源生长因子（

20、PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、神经生长因子（NGF）都在研究中。纠正代谢缺失或改变代谢的重组传递蛋白如胰岛素、人生长激素已上市。治疗急性心肌衰竭的代谢传递蛋白心房肽正在研究阶段。大部分重组结构蛋白药物产品为疫苗,如乙肝疫苗、艾滋病疫苗。结构蛋白药物还可起阻滞剂作用,如CD4蛋白位于淋巴细胞表面是人类免疫缺陷病毒（HIV）的受体。人肺表面活性剂对早产儿呼吸道疾病可能是有益的,正在进行临床试验。 主要治疗急性心肌梗塞的重组t-PA是修饰类基因工程蛋白的主要代表,已于1987年被批准上市。另一种修饰蛋白是具有清除超氧自由基作用的重组人超氧化物歧化酶（SOD）,目前正在研究中。随着研究的不

21、断深入,基因工程对人类生命的影响越来越大。治疗艾滋病、心脏病、肿瘤、传染病等疑难病症的药物将是生物医药工业发展的重点。从销售情况看,基因工程药物的销售额每年都以很高的速度上升。1992年美国生物医药的销售额为24亿美元,其中EPO和G-CSF占10亿美元。到2002年,预计美国的生物医药市场将超过90亿美元,而全球整个生物医药市场将达8 500亿美元。表2是部分基因工程药物销售情况及预测。与发达的国家相比,我国基因工程研究起步较晚,但政府对于发展生物技术给予了足够的重视,把生物技术研究放在高新技术领域的首位。我国第一个进入产业的基因工程药物IFN-A1,1989年经卫生部批准获新药证书,随之I

22、FN-A1b,IFN-A2a型也获得卫生部批准,并生产投放市场。这标志着我国基因工程制药的研究和开发已跻身于世界先进国家行列。乙型肝炎表面抗原基因工程疫苗已在我国研制成功,1991年完成中试,已形成一定规模的生产能力,经临床试验抗体阳转率达100%。这是我国投放市场的第一种高新技术疫苗。1994年IL-2也获卫生部新药证书,基因工程hGH,t-PA,hEGF,EPO等10几种蛋白质或多肽药物也正在进行中试或临床试验。另外,在反义技术、蛋白质工程、糖工程等方面,我国也投入人力物力,许多实验室取得了理想的成果。 医药生物技术在生物技术中一直是最活跃占比重最大的领域。基因工程技术不仅是药物的生产手段

23、,也是医药学的有力研究手段。进入21世纪时,基因工程可能成为发现新药的主要科学推动力。但就目前来看,基因工程毕竟是一项十分复杂的系统工程,其中的“上游工程”固然十分重要,如实验室中合适载体宿主系统的建立、目的基因的DNA序列测定、DNA片段的化学合成、工程菌的构建及高效表达等,但从使实验室成果产业化、商品化的角度看,“下游工程”就显得更为重要,如工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计制造、电子计算机的优化控制等。因此,我们必须花大力气加强“下游工程”的研究和开发,加快“上游工程”

24、的产品化、工业化和商品化的进程。2.4动物细胞工程制药 所谓动物细胞工程，是根据细胞生物学及工程学原理，定向改变动物细胞内的遗传物质从而获得新型生物或特种细胞产品的一门技术。这一技术在生物制药的研究和应用中起关键作用，目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80%，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等。当前动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞核移植技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等方面。2.4.1细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，不仅在农业

25、、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合技术的基础上 Kohler G和 Milstein C将能产生特异性抗体的原代 B 淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的方法 5 。国内外已培育出了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体，如甲肝病毒、抗人IgM 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFR（Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等7-9。目前单克隆抗体技术已趋成熟，许多产

26、品已经进入产业化的生产阶段。此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗，肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究的热点, 在各种动物模型及病人身上观察到肿瘤的消退9-11。Avigan 等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4 的自体血清中培养，加入聚乙二醇使两种细胞产生融合, 融合细胞疫苗能使肿瘤消退 10 ，显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。2.4.2 转基因动物利用转基因动物乳腺反应器生产药用或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身

27、的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。20 世纪 80 年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河13-14。据美国遗传学会预测，到 2010 年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达 9 5 。国外现已有数十家以动物乳腺反应器为核心技术的公司，可生产 1 抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白蛋白、人血红

28、蛋白及人凝血因子、和抗凝血酶、血纤维蛋白原、tPA 等十余种稀有药品，但只有为数极少的几种药用蛋白上市。2006年6月，由美国 Genzyme 转基因公司研制成功的世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物棗重组人抗凝血酶 （商品名：ATryn 牋）已经获准上市12。我国自1998年在国家“863”计划中将“转基因动物乳腺生物反应器”作为重大研究项目以来，也取得了一些较好的成绩。1996年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子、EPO 的转基因羊；1 998年曾溢滔等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛;2000年中国农业大学与北京兴绿原生物技术中心合作，成功获得了我国首例转有

29、人a l一抗胰蛋白酶基因的转基因羊1131；2005年中国农业大学和北京济普霖生物技术有限公司联合研制的人乳铁蛋白和人乳清白蛋白转基因奶牛均获得高效表达，含量分别达到3.4克/升和 1.5克/升，标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白15-16。目前科学家们正在加紧开展重组蛋白纯化、临床前试验和临床试验等研究，力争早日实现我国动物乳腺生物反应器制药技术产业化。2.4.3细胞核移植技术，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。科学家们已经先后在绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代，目前，体细胞克隆也

30、在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了成功。若将转基因与细胞核移植技术获得的克隆动物工厂相结合，在生物制药方面具有巨大的潜在应用价值。1998年，Rohl 等用非静息期胎儿或纤维细胞成功克隆出 3只健康、同类的携带外源标记基因的转基因克隆17。Schnieke 等18用此法成功克隆出 3 只携带有人凝血因子X基因转染绵羊早期胎儿成纤维细胞，以该细胞系为供体移植到去核卵母细胞中，经过电和化学刺激后，将卵母细胞植入假孕母绵羊体内发育，获得这 3 只绵羊，这 3 只绵羊能高水平地表达人凝血因子 X （125g/ml ）。Cibelli等19同样也获得3头转基因牛。这些研究展示了转基因克隆动物技术的可能性，

31、为细胞工程制药带来了光明前景。 动物细胞的大规模高效培养技术是生物制药的关键技术，通过动物细胞培养生产生物产品已成为全球生物工业的主要支柱。目前动物细胞培养生产较多的生物制剂是蛋白和抗体，通常采用中国仓鼠的卵巢细胞，事先将能产生某种蛋白质药品的基因片段与仓鼠卵巢细胞的 DNA 融合再在培养液中大量培养它们、最后得到所需药品。与微生物发酵法比，虽然产量相对较低。但设备费用节省得多，如属于小品种、小产品类生物工程产品，可采用此法。 目前用于动物细胞体外培养的生物反应器有机械搅拌式、气升式、中空纤维式、回转生物反应器等。国外占主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术20-21。美国 Genentech 公司使用 CHO 细胞以12,000L搅拌式生物反应器培养槽生产t - P A 重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。美国 Gibco公司建立的流加悬浮培养rCHO 表达rGal系统，采用化学修饰的无蛋白CHO细胞培养基并增加TCA循环生物反应器中活细胞密度最