PCR技术包含引物设计Word文档下载推荐.docx

1、用酶法在一通用引物反转录cDNA3-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。（3）不对称PCR技术（asymmetric PCR）：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用501001比例。在最初的1015个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。（4）反转录PCR技术（reverse transcription PCR, RT-PCR）：当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛,

2、无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。（5）巢式PCR技术（NEST-PCR）：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了

3、交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。（6）多重PCR技术（multiplex PCR）：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5-端和3-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。（8

4、）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。（9）荧光定量实时PCR技术反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=（1+X）n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段

5、不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是

6、固定的，故这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。反应五要素-引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+（1）引物设计引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，引物自身连续互补碱基

7、不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。 【引物的GC含量和Tm值应该协调：Tm=4（G+C）+2（A+T）】避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 5端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好

8、处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度1umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（2）DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量 U/50 ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到，小量分装， -

9、20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（ 等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。（4）模板（靶基因）核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋

10、白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。RT-PCR - 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。总RNA提取（-70保存）Trizol法：1、取组织100于玻璃匀浆器中，加入1ml Trizol 冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）2、移入管中，颠倒混匀，室温保存5m

11、in3、加氯仿（总体积的1/5），振荡混合，室温放置5min4、4，离心12000 rpm，15min 5、取上层液相（约400l）移入一新 EP管中，加等体积异丙醇（约400l）,振荡混合，室温保存10min6、4，离心12000 rpm，10min7、弃上清液，加1ml 75%无水乙醇（4保存），振荡混合8、4，离心7500 rpm，5min9、弃上清液，室温放置20min（EP管倒置在滤纸上）使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60孵育3-5min（或手握3-5min）,使RNA充分溶解（ 可保存在液氮或低温冰箱-70）测RNA浓度：走RNA变性电泳

12、观察18s、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值调零：750ul DEPC水测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA总RNA浓度= OD26040稀释倍数（150倍）ug/ml = OD260150 ug/ml6 ug/ulA1/A2应在之间注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在左右，当OD260/OD280时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。逆转录RT（cDNA：一周内-20保存，长期-70保存）RT

13、反应体系：20ul体系第一步：约20分钟RNA抽提物 5lRadome引物 2lRNAsin l1、65 15分钟 2、立即放入冰浴 第二步：约2小时10mM dNTP 1l5 RT缓冲液 4l25mM MgCl2 4l AMV 3l1、37 小时 2、94 5-10分钟 3、反应物保存于-20或进行PCR聚合酶链反应PCR（产物-20保存）PCR反应体系：100l体系 约小时 约5小时25mM MgCl2 2l 3l10PCR缓冲液 5l 5l10mM dNTP 1l 1l10pmol/l上游引物 l l10pmol/l下游引物 l lcDNA模板 l 5lddH2O 34l 30lTaq酶

14、 l 1l轻质石蜡油 50l 50l1、94 2分钟，55 1分钟，72 2分钟 为第一个步1个循环 2、94 45秒，55 40秒，72 1分钟 为第二步30/40个循环 3、72 10分钟 4、取出后4保存，5分钟后-20保存或走电泳琼脂糖凝胶电泳：约小时1、配制 TBE电泳缓冲液300 ml 2、配制凝胶浓度%（40ml TBE加胶），微波炉中火2分钟溶解胶，冷却至60加入溴乙锭2l（10mg/ml的终浓度g/ml），充分混匀3、将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳4、加样8l PCR反应产物+2l溴酚兰 ，空一格加DNA marker5、电泳50

15、-80V ，电场强度不宜高于5V/cm6、在紫外灯下观察,DNA 存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系 统拍照保存。电泳缓冲液（5TBE贮存液）：Tris 54g、硼酸、 EDTA 20ml 、加蒸溜水至1000ml。使用时，将5TBE稀释10倍成TBE就可以在电泳时使用（工作浓度）。上样缓冲液（6缓冲液，4保存）：%溴酚蓝、%二甲苯青FF、30%甘油琼脂糖凝胶配制：（%）琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾（如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志），熔化的琼脂物冷却至60时加入10mg/ml溴化乙锭5l，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45

16、min（可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固）后现进行电泳。%同上，将琼脂糖的量改为。试剂：1、DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1DEPC水，并充分振荡混匀备用。2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20保存。（DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出）。3、异丙醇：放入棕色瓶中。4、氯仿：5、轻质石蜡油Trizol：一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含

17、有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂随机引物、Oligo（dT）、基因特异性引物：用于反转录的引物可视实验的具体情况选择M-MLV、AMV（配10RT-buffer）：逆转录酶RNasin：RNA酶抑制剂dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP）Taq酶（配10PCR-buffer、MgCl2）：DNA聚合酶Primer（上游、下游）Marker：是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。附：TBE（Tris硼酸缓冲液）