染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞SKOVWord下载.docx

1、 Various concentrations of genistein in combination with cisplatin resulted in the reduction of IC50 by % in SKOV3 cells. The combination index of genistein and cisplatin in SKOV3 cells ranged from to , which indicated that they acted in a slightly to highly synergistic pattern. The apoptotic rate w

2、as also significantly raised by combination of genistein and cisplatin, which showed a relationship with G2/M arrest and the disturbance of S phase because there was a negative correlation between apoptotic rate and G1 phase cell fraction（rs=, P<）. CONCLUSION: Genistein can significantly improve

3、the growth inhibition and cytotoxicity effects of cisplatin on SKOV3 cells and the two agents act in a synergistic way. These synergistic effects may be related to the G2/M arrest and the disturbance of S phase by genistein.【Keywords】 genistein; cisplatin; ovarian neoplasms; drug synergism【摘要】 目的：探讨

4、染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞系SKOV3增殖与凋亡的影响. 方式：采用MTT比色法检测染料木黄酮和顺铂联用对SKOV3细胞增殖的影响，Hoechst染色荧光显微镜下观察联合用药后细胞形态的改变，流式细胞仪分析细胞周期并检测凋亡率. 结果：联用不同浓度的染料木黄酮后顺铂对SKOV3细胞IC50降低率为%,两药联合作用系数在之间，为轻度至高度协同作用. 染料木黄酮与顺铂联用可显著提高凋亡率，两药联用诱导SKOV3细胞凋亡和阻滞G2/M期、干扰S期进程，凋亡率与G1期细胞比例呈负相关（rs=, P&）. 结论: 染料木黄酮可以增强顺铂对SKOV3细胞的增殖抑制作用和杀伤作用，两种药物具有协同

5、作用. 染料木黄酮阻滞细胞于G2/M期并同时干扰S期进程可能是两药发挥协同作用的重要机制.【关键词】 染料木黄酮；顺铂；卵巢肿瘤；药物协同作用0引言最近几年来染料木黄酮（4，5，7三羟基异黄酮，genistein）对肿瘤生长的抑制作用日趋受到重视，尤其是它可以增强常规化疗药物的疗效1-2. 而染料木黄酮和传统化疗药物顺铂联用可否增强顺铂对耐药卵巢癌的杀伤作用呢？为此，咱们研究了染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌SKOV3细胞增殖与凋亡的影响及其机制.1材料和方式材料人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3由西京医院妇产科实验室保留，该细胞系对顺铂等多种药物耐药；RPMI 1640培育基（Gibc

6、o公司）；新生牛血清（四季青公司）；顺铂（齐鲁制药厂）；染料木黄酮、二甲基亚砜（DMSO）,Hoechst33342（Sigma公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Amresco公司）. 细胞周期检测试剂盒为DNAPrep Stain kit（BeckmanCoulter公司）；Wellscan MK3型全自动酶标仪（Labsystems Dragon公司）；ELITE ESP型流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）.方式法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的SKOV3细胞，8103个/孔接种于96孔培育板，置37，50 mL/L CO2培育箱培育12 h，细胞贴壁后弃去培育液，然后加入含不

7、同浓度药物的培育基200 L：对照组只加RPMI 1640培育基（100 mL/L小牛血清）；顺铂组加入顺铂浓度别离为，5，10，20 mg/L的培育基；染料木黄酮组加入染料木黄酮浓度别离为，5，10，20，30，40，50 mg/L的培育基；染料木黄酮和顺铂联用组为，5，10，20 mg/L的染料木黄酮与顺铂联用，顺铂浓度同单药组，每组均设6个复孔. 继续培育至加药后96 h，每孔加入MTT（5 g/L,20 L）,继续孵育4 h后弃培育液，每孔加入DMSO 150 L，振荡10 min，用酶标仪检测各孔吸光值（A490 nm），按以下公式计算：细胞增殖抑制率=（对照组A490 nm-实验组

8、A490 nm）/对照组A490 nm100%，取6复孔均值绘制抑制率与药物剂量关系曲线，按作图法求出半数抑制浓度（IC50）. 同时采用联合作用指数（combined index，CI）判断染料木黄酮和顺铂联用的性质. CI=DAICX,A+DBICX,B （A，B代表两种不同药物，ICX,A和ICX,B是两种药物单独利用使生长抑制率达X时的药物浓度，DA和DB是两药联用使生长抑制率达X时两种药物的浓度）3. 按照Soriano等4的判断方式，CI为叠加作用，CI&为低度协同作用，CI&为中度协同作用，CI&为高度协同作用，CI&为强协同作用.荧光染色观察细胞形态的改变接种SKOV3细胞于盖

9、玻片，置于六孔板内，细胞贴壁后加入不同药物，按照MTT结果分为4组：即对照，顺铂（ mg/L），染料木黄酮（10 mg/L）和染料木黄酮（10 mg/L）+顺铂（ mg/L）. 继续培育36 h，固定后加入 mL Hoechst33342（10 mg/L），染色15 min后弃染液清洗，抗荧光淬灭液封片，紫外光激发，在荧光显微镜下观察.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的转变搜集SKOV3细胞，调整细胞密度为5107/L，以每瓶8 mL接种于75 mL培育瓶，细胞贴壁后弃去培育液，加入含不同浓度药物的培育基. 按照MTT结果，顺铂浓度选 mg/L, 染料木黄酮浓度选5和10 mg/L，设对照、单药和

10、联用共6组. 加药36 h后搜集细胞，别离按DNAPrep Stain Kit试剂盒和Apoptosis Detection Kit试剂盒说明书进行细胞固定、染色，上流式细胞仪分析.统计学处置： SPSS 软件进行秩相关分析.2结果染料木黄酮与顺铂联用对SKOV3细胞增殖的影响染料木黄酮、顺铂单药的IC50别离为 mg/L和 mg/L，4种不同浓度的染料木黄酮与顺铂联用后顺铂的IC50明显降低，与单用顺铂组比较，4种不同浓度的染料木黄酮可使顺铂的IC50别离降低到，和 mg/L（图1）. 当达到半数抑制时，不同浓度组合的染料木黄酮与顺铂的CI别离为，. 其中10和5 mg/L染料木黄酮与顺铂联

11、用达到高度协同作用； mg/L和 mg/L染料木黄酮与顺铂联用别离达到低、中度协同作用.染料木黄酮与顺铂联用后SKOV3细胞形态的改变对照组细胞核均匀淡染，界限清楚，呈正常结构（图2A）；顺铂组与对照组无明显不同（图2B）；染料木黄酮组可见少量凋亡细胞（图2C）；联用组出现大量典型的凋亡细胞：细胞核染色明显增强，荧光更为敞亮，强度深浅不一，并可见浓染致密的染色质凝集，呈颗粒状、固缩状或团块状结构（图2D）.染料木黄酮、顺铂单药及联用对SKOV3细胞周期及细胞凋亡的影响对照组绝大多数细胞处于DNA合成前期，G1期细胞比例高，S期和G2期细胞较少，凋亡率很低； mg/L顺铂组对SKOV3细胞周期和

12、凋亡率无明显影响；5和10 mg/L染料木黄酮组均成倍升高G2/M期细胞比例并增加凋亡率，10 mg/L染料木黄酮还进一步的升高了S期细胞比例； mg/L顺铂+5 mg/L染料木黄酮和 mg/L顺铂+10 mg/L染料木黄酮组可使G2/M期阻滞和细胞凋亡取得显著增强. 各组SKOV3细胞G1期比例随着不同浓度染料木黄酮与顺铂的处置而改变，经直线相关分析，表明细胞凋亡和G1期细胞比例呈负相关（rs=, P&），与G2/M期+S期的细胞比例成正相关（表1）.表1不同浓度染料木黄酮与顺铂诱导的SKOV3细胞周期和凋亡率的改变（略）3讨论铂类药物是卵巢癌联合化疗方案中最常常利用的药物，而卵巢癌对铂类药

13、物的耐药性及其毒副作用常常致使化疗方案难以奏效. 最近几年来研究表明染料木黄酮具有抑制肿瘤细胞生长、增进凋亡的作用，可以增强前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤细胞对化疗的敏感性，提高化疗的效果，而且可以在不降低疗效的前提下减少化疗药物用量，从而减轻化疗的毒副反映1-2. 那么染料木黄酮可否增强传统化疗药物顺铂对耐药卵巢癌的疗效呢？在实验中咱们发现SKOV3细胞明显对顺铂耐药，其IC50达到 mg/L，远远超出顺铂的血浆峰值浓度（ mg/L），而染料木黄酮与顺铂联历时则表现出不同程度的协同作用，可明显降低顺铂对SKOV3细胞的IC50，10 mg/L浓度以上的染料木黄酮可将顺铂对SKOV3细胞的IC

14、50降至血浆峰值浓度以下，两药联用也显著的提高了凋亡率. 采用荧光显微镜观察细胞形态，也可以发现血浆峰值浓度的顺铂对SKOV3细胞几乎没有什么影响，而与染料木黄酮联历时可诱导出大量凋亡.流式细胞术结果提示周期阻滞和细胞凋亡是染料木黄酮与顺铂发挥协同作用的重要机制，而且两药协同诱导细胞凋亡与周期阻滞是有联系的. 凋亡率与G1期比例呈负相关, 间接的表明染料木黄酮与顺铂联用诱导凋亡和阻滞G2/M期和干扰S期进程有关. 染料木黄酮可将SKOV3细胞阻滞于G2/M期，并诱导必然程度的细胞凋亡，而G2/M期正是顺铂诱导凋亡的重要时期5，二者在这方面的一致性可能是它们发挥协同作用的基础. 在咱们的结果中，

15、10 mg/L 染料木黄酮可进一步地将一部份细胞阻滞于S期. 实验中发现5，10 mg/L染料木黄酮联合顺铂作历时，G2/M期细胞比例相近，但凋亡率却不同甚远，提示两种浓度的染料木黄酮对S期干扰程度的不同可能是造成凋亡率不同的原因. S期即DNA合成期，核苷酸双链在S期分离，对外界环境超级敏感，更易于被肿瘤化疗药物所杀伤，干扰S期进程理论上应该会增加凋亡率. Kolfschoten等6采用顺铂加阿霉素化疗方案医治15例包括不同组织学类型的卵巢癌移植瘤裸鼠，发现顺铂不敏感裸鼠S期肿瘤细胞比例较低，而S期肿瘤细胞比例较高的裸鼠对顺铂敏感性较强，顺铂敏感性与S期细胞比例成正相关. 高浓度的染料木黄酮

16、可干扰S期进程可能是其与顺铂发挥协同作用的另外一个重要机制.咱们的研究表明，染料木黄酮和顺铂可协同抑制耐药卵巢癌细胞SKOV3的增殖、增进其凋亡，这对强化常规化疗的效果、减轻化疗的毒副作用是超级成心义的. 其作用机制可能与染料木黄酮干扰细胞周期，从而增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性有关. 染料木黄酮增强顺铂对耐药卵巢癌细胞SKOV3的杀伤作用的分子机制还有待探讨.【参考文献】1 Li Y, Ahmed F, Ali S, et al. Inactivation of nuclear factor kappaB by soy isoflavone genistein contributes to i

17、ncreased apoptosis induced by chemotherapeutic agents in human cancer cellsJ. Cancer Res，2005,65（15）:6934-6942.2 Li Y, Ellis KL, Ali S, et al. Apoptosisinducing effect of chemotherapeutic agents is potentiated by soy isoflavone genistein, a natural inhibitor of NFkappaB in BxPC3 pancreatic cancer ce

18、ll lineJ. Pancreas，2004,28（4）:e90-e95.3 李也鹏,胡成平,吴鄂生. NS398和顺铂联用对人肺腺癌增殖的影响及其机制初步探讨J. 中国肺癌杂志，2005,8（1）:8-13.4 Soriano AF, Helfrich B, Chan DC,et al. Synergistic effects of new chemopreventive agents and conventional cytotoxic agents against human lung cancer cell linesJ. Cancer Res， 1999,59（24）:6178-6

19、184.5 Bose RN. Biomolecular targets for platinum antitumor drugsJ. Mini Rev Med Chem，2002,2（2）:103-111.6 Kolfschoten GM, Hulscher TM, Pinedo HM, et resistance features and Sphase fraction as possible determinants for drug response in a panel of human ovarian cancer xenograftsJ. Br J Cancer，2000,83（7）:921-927.