1、 2.消毒和灭菌的辨析项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属工具高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌3.两种纯化细菌方法的比较优点缺点适用范围平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征操作复杂、需要涂布多个平板适用于厌氧菌和兼性厌氧菌（1）认清不同生物需要的营养物质不同微生物需要的营养成分有水
2、、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。在人和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳三类。（2）平板划线操作的注意事项操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要对接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的不同：a第一次操作目的是杀死接种环上原有的微生物。b每次划线之间操作目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少。c划线结束操作目的是杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。灼烧接种环，待其冷却后才能伸
3、入菌液，以免温度太高杀死菌种。第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。划线时最后一区不要与第一区相连。划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。1如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：（1）图甲是利用_法进行微生物接种，图乙是利用_法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是_和_；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是_和酒精消毒。（2）接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？_。（3）接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？（4）如图是采用上述接种方法接种后培养
4、的效果图解，其接种方法是_（填“图甲”或“图乙”）。解析：图甲和图乙分别是平板划线法和稀释涂布平板法，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器。由于在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。在微生物培养过程中会产生水，对微生物的生长造成影响，故需要倒置培养。答案：（1）平板划线稀释涂布平板接种环涂布器灼烧灭菌（2）火焰附近存在着无菌区域（3）避免培养过程产生的水分影响微生物的生长（4）图乙2（2016高考全国卷丙，39）某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：（1）分
5、离纯化乳酸菌时，首先需要用_对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是_。（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_和_。分离纯化时应挑选出_的菌落作为候选菌。（3）乳酸菌在20 长期保存时，菌液中常需要加入一定量的_（填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”）。（1）分离纯化乳酸菌过程中，需要在固体培养基上培养乳酸菌并得到单菌落。由于泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落，故分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释。（2）由于乳酸菌代谢产生的乳酸可以溶解培养基中的碳酸钙，形成透明圈，故培养基中加入碳酸钙可用于鉴别乳酸菌，同时碳酸钙也可以中和乳酸菌产生的乳酸。（
6、3）乳酸菌在20 长期保存时，菌液中需要加入一定量的甘油，加甘油是为了避免水结冰产生冰晶损伤细胞。（1）无菌水泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落（2）鉴别乳酸菌中和产生的乳酸（或酸）具有透明圈（3）甘油土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（1）分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。（2）统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。2实验流程（1）土壤取样富含有机质的土壤表层土（2）样品的稀释通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数
7、的平板（3）接种用稀释涂布平板法接种（4）培养（5）观察根据菌落的特征区分微生物（6）计数统计菌落的数目（7）计算根据公式“每克样品中的菌落数（CV）MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数”进行计算1选择培养基四种常见制备方法或实例2两种计数方法的比较间接计数法（稀释涂布平板法）直接计数法（显微计数法）原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量公式每克样品中的
8、菌落数（CMC：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：稀释倍数每毫升原液所含细菌数：每小格平均细菌数400104当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落不能区分细胞死活比实际值偏小比实际值偏大3.设置对照和重复比较项目对照重复目的排除非测试因素对实验结果的影响排除偶然因素对实验结果的影响实例空白对照：确定培养基制作是否合格同一稀释度涂布至少3个平板1“选择菌落数在30300的平板”的两个提醒用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30300的平板进行计数。解题时易出现以下误解：（1）只得到1个菌落数在30300的平板是错误的。错误的
9、原因是不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。（2）得到3个或3个以上菌落数在30300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30300”，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。可见，并不是只要得到3个“菌落数在30300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30300之间”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。2选择培养基与鉴别培养基种类制备方法用途举例
10、选择培养基培养基中加入某些化学物质依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计从众多微生物中分离所需的微生物加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌鉴别培养基中加入某种指示剂或化学药品产生特定的颜色或其他变化鉴别不同种类的微生物用伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌1（2016高考四川卷，10）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。（1）图中选择培养基应以_为唯一氮源；鉴别培养基还需添加_作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_色。（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌
11、菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_，每克土壤样品中的细菌数量为_108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较_。 （3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。突变基因转录的mRNA中，终止密码为_，突变基因表达的蛋白质含_个氨基酸。（1）筛选产脲酶细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源；鉴别培养基还需要添加酚红作指示剂，产脲酶细菌产生的脲酶可以将尿素分解成氨，导致培养基的pH升高，菌落周围的指示剂将变成红色。（2）图中过程
12、采取的接种方法是稀释涂布平板法，每克土壤样品中的细菌数量为：（156178191）/30.11051.75108，血细胞计数板计数法所得数据包括死的细菌，且稀释涂布平板法计数时所计菌落数少于真正的活细菌数，故与血细胞计数板计数法相比，此计数法测得的细菌数较少。（3）图乙从起始密码算起的碱基序列号为271，前270个碱基决定90个氨基酸，从271位到箭头处可以决定1个氨基酸，然后插入70个核苷酸，可决定23个氨基酸，多出一个碱基，加上后面的AG刚好可以决定1个氨基酸，则后面UGA是终止密码。因此突变基因转录的mRNA终止密码为UGA，突变基因表达的蛋白质所含氨基酸数为901231115（个）。（
13、1）尿素酚红红（2）稀释涂布平板法1.75少（3）UGA115高考全国卷乙，39）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：配制培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）; 制作无菌平板；设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；将各组平板置于37 恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。（1）该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分X通常是_。（2）步骤中，实验组的操作是（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对
14、照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_现象。若将30（即366）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_（填“正确”或“不正确”）。（1）牛肉膏、蛋白胨都含有N，可为微生物的生长提供氮源。制作无菌平板所用培养基为固体培养基，所以X应为琼脂。（2）根据实验目的可知，本实验的自变量为教室的不同高度，因变量为微生物的分布情况，故实验组的操作应为将实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间。（3）空白培养基上出现菌落，说明培养基被污染了，即调查中出现了污染现象。实验过程中若培养基被污染，必须将其抛弃，重新制作新的培养基进行实验。（1）牛肉膏、蛋白胨琼脂（2）将
15、实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间（3）污染不正确微生物的筛选与鉴别1纤维素酶（1）组成：纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。（2）作用2菌种筛选（1）方法：刚果红染色法。（2）原理纤维素分解菌 红色复合物红色消失、出现透明圈。即：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。3筛选流程土壤取样：富含纤维素的环境选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量梯度稀释涂布平板：将样品涂布于含CR的鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈1微生物的鉴别方法（1）菌落特征鉴别法：根据
16、微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。（2）指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。（3）染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。2筛选微生物的三种方法（1）单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。（2）选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。（3）鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特
17、征，然后筛选目的微生物。3筛选微生物的两个实例比较比较土壤中分解尿素的细菌的分离分解纤维素的微生物的分离方法利用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行选择培养利用富含纤维素的选择培养基进行选择培养只有分解尿素的细菌能够合成脲酶，才能在以尿素为唯一氮源的培养基上生长因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖在培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红说明菌落中的菌体为分解尿素的细菌刚果红染色法，周围出现透明圈的菌落为分解纤维素的微生物的菌落（1）纤维素分解菌的选择培养基中并不只有纤维素一种碳源。（2）纤维素分解菌的选择培养基上生长的并不只是纤维素分解菌。（3）纤维素分
18、解菌菌落周围的透明圈的大小与纤维素分解菌分解纤维素的能力呈正相关。1牛奶是微生物生长的良好培养基。牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物。为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：（1）巴氏消毒的方法是_，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是_。（2）取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是下图中的_。（3）图中所示方法为稀释培养法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别
19、为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为_个，运用这种方法统计的结果往往较实际值_（填“偏大”或“偏小”），原因是（4）从生牛奶取样培养得到的菌落中，混有各种杂菌，从中检测大肠杆菌的方法是在培养基中加入_，菌落具有_特征的可以认定为大肠杆菌。（1）7075 煮30分钟（或80 煮15分钟）牛奶的营养成分不被破坏（2）B（3）3.4106偏小个别菌落可能是由2个或多个细菌形成的（4）伊红美蓝（金属光泽的紫）黑色2（高考新课标全国卷改编）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将_分解成
20、_。（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成_色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的_。（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见表）：酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水基甲基乙注：“”表示有，“”表示无。据表判断，培养基甲_（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_；培养基乙_（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是 （1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二
21、糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。（2）刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。（3）纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。（1）纤维二糖葡萄糖（2）红透明圈（3）不能液体培养基不能用于分离单菌落不能培养基中没有纤维素，不会形成CR纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素
22、分解菌3（2017河北邯郸一模）某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如图所示。请分析回答下列问题：（1）培养基中加入化合物A的目的是_，这种培养基属于_培养基。（2）“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的_。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是_。（3）在上述实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是_。（4）转为固体培养基时，常采用平板划线的方法进行接种，此过程中所用的接种工具是_，操作时采用的灭菌方法是_。（5）实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是（6）某同学计划统计污水池中“目的菌”的总数，他选用104、105、106稀释液进行平板划线，每种稀释液都设置了3个培养皿，从设计实验的角度看，还应设置的一组对照实验是_，此对照实验的目的是_。（1）该实验的目的是筛选“目的菌”，故培养基中添加的化合物A起选择作用。（2）微生物正常生长需要碳源、氮源、无机盐等，由培养基中添加的物质种类知：化合物
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