ChIP实验精讲做科研的必看Word格式文档下载.docx

1、0.1% Sodium Deoxycholate0.1% SDSProtease Inhibitors （每次新鲜加入）注意事项：使用悬浮细胞实验时，加入0.75% （v/v）的甲醛和甘氨酸后，5分钟，1000g离心沉淀细胞。冰冷 PBS 洗 3 次，用 SDS Lysis Buffer重悬细胞（每 1 X 107 细胞加 800 l）。2. 组织免疫沉淀样品的制备 每个IP反应建议使用肝组织 30 mg，可按实际情况调整。 每种组织的用量依据组织蛋白丰度、抗体亲和力和交联效率而定。 每个IP反应最适染色质的量为5-15 g 。 每次交联免疫沉淀反应之前，需根据不同组织类型确定具体的染色质需要

2、量。 所有溶液中均应添加蛋白酶抑制剂protein inhibiter （cocktail）。2.1. 交联反应 冰冻组织应置于冰上融化。 冰冻组织融化时温度不能过高，以免蛋白酶活化使组织降解。 操作过程中要一直在冰上进行，尽量缩短操作时间防止蛋白降解。2.1.1.将冰冻或新鲜组织切成小块（1-3 mm3） 。2.1.2. 取一个空的15 ml 离心管，称重，放入组织后再次称重，计算组织重量。2.1.3.每克组织加10 ml PBS。加入终溶度1.5% （v/v） 的甲醛，室温旋转15 分钟。2.1.4. 加入甘氨酸至终浓度0.125M，终止交联反应，室温旋转5 分钟。2.1.5. 4 C，7

3、20 rpm，离心 5min。2.1.6. 弃上清，用加入10ml 预冷的PBS 洗涤。4C，720rpm，离心5 min，弃上清。 所得组织可用液氮速冻，保存于 -80 C。 避免反复冻融。 使用时可用预冷PBS 重悬组织，每克组织加10 ml，置冰上解冻。2.2.降解组织 2.2.1. 剪掉1 ml 枪头的末端，使吸头口增大。2.2.2. 用1ml PBS 重悬50-100 mg组织。2.2.3. 将溶液加入锥形研磨管中，研磨2 分钟。2.2.4. 用1 ml 注射器连接18号钝圆针头，插入研磨管中收集细胞。将细胞加入一个锥形管中，冰上放置。2.2.5. 显微镜下观察细胞悬液，以确定得到的

4、是单细胞悬液。2.2.6. 1000 rpm, 4 C，离心 10 分钟收集细胞。2.2.7. 弃上清，用SDSLysis buffer重悬沉淀（每1x107 个细胞加入 800 l）。2.2.8. 超声处理。3. 超声 3.1超声处理裂解液，将DNA打断成500-1000 bp 范围内的片段。 使用组织进行实验时，要得到单细胞悬液，需从超声处理开始。 细胞系不同，需要超声的时间也不同，需要分别优化得到最佳条件。 取部分样本使用1.5%（质量百分比）的琼脂糖凝胶电泳，分析超声结果。33.2 超声处理后，4C，10，000 g ，离心 10min，以除去细胞碎片。转移上清至新管中。 3.3 超声

5、后的样本各取50 l，测量DNA 浓度，用为PCR 对照。超声后溶液可在液氮中速冻，可于 -80 C保存 2 个月。 避免反复冻融，以免样品降解。 超声时间过长会使核小体与DNA 的交联断裂，一般超声时间为15min。4. 纯化DNA4.1 试剂盒纯化DNA 加入 2 lRNA 酶A （0.5 mg/ml）。 65 C ，4-5小时（或过夜），解交联。 按照 DNA纯化试剂盒说明书纯化DNA。 样本可于 -20C保存。使用 DNA 纯化试剂盒纯化 DNA 时，应加入 RNA 酶 A 处理样品，以免RNA 浓度过高减少 DNA 的最终纯化量。4.2 酚:氯仿抽提纯化DNA 加入 5l 蛋白酶K

6、（20mg/ml）。 65C ，4-5 小时（或过夜），解交联。 等体积酚:氯仿抽提 DNA样品3次。 取水相加入 10l 糖原（5mg/ml），2倍体积无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥10min。 加入100 l水溶解沉淀。 样本可于 -20C 保存。使用蛋白酶 K 消化样品，可以水解蛋白质，使蛋白质与DNA 解交联，以促进DNA 的纯化。4.3 DNA 浓度测定 取 5 l 纯化 DNA， 稀释200倍，测定OD 260。 DNA 浓度（g/ml）=OD260x 10,000，计算DNA浓度。5. 免疫沉淀 5.1. 使用超声处理所得溶液进行免疫沉淀反应。建议： 沉淀反应 D

7、NA 含量约为 25 g 。 每个样本用RIPA 缓冲液 稀释10倍。 设一个抗体对照和一个仅加磁珠（不加抗体）的对照。RIPA buffer配方：50 mM Tris-HCl pH8150 mM NaCl2 mM EDTA pH81% NP-400.5% Sodium Deoxycholate5.2.样本中均加入一抗（对照样品不加）。 先进行预实验得到最佳的抗体加入量。 每 25 gDNA 一般加入1-10 g 抗体。5.3.样品中加入20 l 的 protein A/G 磁珠，免疫沉淀（IP），4 C，缓慢旋转过夜。5.4. 2000g离心1min收集磁珠，弃上清。5.5. 用1 ml 低

8、盐washbuffer洗涤磁珠3 次。2000g离心1 分钟。低盐Washbuffer配方：20 mM Tris-HCl pH85.6. 用高盐washbuffer洗1 次。高盐washbuffer配方：500 mM NaCl 如果背景过高，则应增加洗涤次数。 超声处理后的染色质先与proteinA/G 磁珠共孵育1 小时，将消除与磁珠的非 特异行结合，降低背景。6. 免疫复合物洗涤和解交联 6.1 回收DNA：向 protein A/G 磁珠中加入 120 l Extraction buffer，30 C， 旋转15 分钟。Extraction buffer配方：1% SDS100mM Na

9、HCO36.2 2000g 离心1 分钟。将上清转移至新管中。样本可于-20 6.3. 纯化DNA 可用 DNA纯化试剂盒或酚:氯仿抽提进行（参照上面步骤）。6.4. DNA 可用Realtime-PCR进行定量检测。二、 ChIP 常见问题1. ChIP是什么？答：染色质免疫沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。2. ChIP有哪些应用？近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发

10、展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。3. ChIP技术的原理？生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而

11、且对结果的分析也需要有一定的经验。4. 做ChIP试验，必须做甲醛固定么？不一定，视样品及试验方案而定。做甲醛固定的为X-ChIP，而不需要固定的为N-ChIP。甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。5. 为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小（大约3个核小体400-500bp）?为确保ChIP实验有良好精度。若您的平均片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含您目标序列的DNA，但所要研究的蛋白会离您目标序列有

12、700个核苷酸的距离。6. 为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子？为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应？鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。实验者不太可能对鲑鱼组织做ChIP实验，所以此DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。7. 引物最佳设计是什么样的？引物长度应为24个核苷酸，应含有50%GC碱基对，Tm值为60不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。不必考虑基因组内不独一序列。8. 您推荐下如何从琼脂糖（或琼脂糖凝胶）中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物，用来做re-ChIP试验？在ChIP分析试剂盒内可找到洗脱缓冲液，用它洗脱复合物。对于re-ChI

13、P，有必要添加蛋白酶抑制剂到免疫沉淀洗液和洗脱缓冲液，及第二轮实验用的稀释缓冲液。请确定所有溶液处于低温，蛋白质不会因此而在收集第一次免疫沉淀的复合物或第二次免疫沉淀时降解。9. 蛋白A琼脂糖能被用于小鼠IgM?答:蛋白质A不能与小鼠IgM结合。可以考虑用一个桥接抗体连接。10. 在做ChIP之前，有办法纯化细胞核么？在细胞与甲醛交联后，细胞核可通过“溶胀缓冲液”培育及剪刀细胞均质器（douncehomogenization）制备（至少10倍体积）。溶胀缓冲液：25M Hepes, pH 7.81.5mM MgCl210mM KCl0.1% NP-401mM DTT0.5mM PMSF蛋白酶抑

14、制剂混合剂然后按照protocol在SDS裂解液中裂解11. ChIP超声波的最佳条件？1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物，避免有气饱（气泡产生）。超声波仪会替你做这些。 2脉冲应在10秒（与体积一致）。 3. 样品量小于400uL间隔应大于1分钟，在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。 4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部（不能让探头碰到管壁）。 5若发现泡沫，立即停止超声，置于冰上。旋转EP管以去除泡沫，继续超声。 6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。12. 客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么？是，实际上比起全细胞，细胞核更好。我们用全细

15、胞裂解物，因为它更简便，通常也能得到好结果。此页有一些相关信息：http:/www.epigenome-13. 我是否可以改变逆转交联的时间和温度?并不推荐少于4个小时的逆转交联.但是,可以将样本在65度过夜逆转交联.需要注意的是,样品不能干掉。14. 做组蛋白ChIP时, 什么时候不需要交联?nativeChIP中,Histone H3 and Histone H4 都不需要交联反应,因为它们本身来说和DNA结合的非常紧密.组蛋白H2A和H2B并不是紧密联接,但是在nativeChIP中依然可以不需要交联反应。15. 什么是inputDNA? Output DNA?从染色质 上获得的未做过I

16、P的已经被逆转交联的DNA.它是检查PCR是否有效的对照。OutputDNA是来自每次IP实验的DNA.其实就是genomicDNA. 在ChIP实验中,sonication 或酶解后,样本取部分不做IP,直接逆转交联.它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work.通常情况下,在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work。16. 通过改善交联是否能提高ChIP的enrichment?Notlikely.Formaldehyde is a very reactive dipolar compound in whichthe carbon atom acts as a nuc

17、leophilic center for amino and imino groups ofamino acids （Lys, Arg, and His） and of DNA （primarily A and C）, leading to theformation of a Schiff base. This intermediate can further react with a secondamino group, resulting in the final DNAprotein complex 1-3. Your protein, orthe protein-DNA complex

18、, also crosslink with other proteins and lipids, via thesame mechanism,. Increasing formaldehyde concentration and/or the incubationtime may adversely affect immunoprecipitation. It is recommended that youoptimize other parts of the protocol for improvement.17. 如何来量化经IP后的DNA?DNApurified from ChIP ex

19、periments can be quantitated by PCR, providing theamplifying oligos meet specific criteria. Oligos should be 24 mers, with a GCcontent of 50% （+/- 4） and a Tm of 60.0C （+/- 2.0）. You must be certain thatthe PCR reactions are within the linear range of amplification. Generally ittakes time to achieve

20、 this. Too much input DNA will affect your results, so setup several tubes for each experiment to optimize the input DNA. Generally, thisis about 1/25th to 1/100th for yeast, approximately 1/10 for mammalian cells,but depends on the amount of antibody and input chromatin. Also, do not usemore than 2

21、0 cycles, making sure that dNTPs always remain in excess. Also,include each reaction a control primer （to compare your experimental bandagainst-make sure the sizes are sufficiently different to allow properseparation-75 base pairs is usually OK） set to a region of the genome thatshould not change th

22、roughout your experimental conditions. Also PCR frompurified input DNA （no ChIP） and include no antibody control PCRs as well. PCRproducts should be no more than 500 base pairs and should span the area ofinterest （where you think you will see changes in acetylation or methylation ofhistones）. All PC

23、R products should be run on 7-8% acrylamide gels and stainedwith SYBR Green 1 （Molecular Probes） at a dilution of 1:10,000 （in 1XTris-borate-EDTA buffer, pH 7.5） for 30 minutes-no destaining is required.Quantitation is carried out subsequent to scanning of the gel on a MolecularDynamics Storm 840 or

24、 860 in Blue fluorescence mode with PMT voltage at 900with ImageQuant software. This has distinct advantages over ethidium bromidestaining. SYBR Green is much more sensitive, and illumination of ethidiumstained gels can vary across the gel based on the quality of UV bulbs in yourin your light box. F

25、or further info, see Strahl-Bolsinger et al. （1997） GenesDev. 11: 83-93. A radioactive quantitation method is described in Suka et al（2001） Molec. Cell, 8: 473-479.18. 为什么ChIP试验需要用经验证的抗体？抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的，有的抗体识别的抗原表位比较小，不容易暴露，在ChIP实验中容易被DNA包裹，从而使抗体无法结合，因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的，商业化的抗体都

26、应该是验证过的。19. 如何确保在最大功率下超声裂解不起泡1.Use the volume of SDS lysis buffer you choose, cool on ice 2. Startsonication with increasing power until foaming occurs. 3. Lower thepower a little. This is the power you can use （for instance, if it startsfoaming at 40%, then 35% should be OK）. 4. Cool theabove vial

27、and sonicate for one pulse. Touch the vial without glove and itshould not be hot （warm is OK）, otherwise shorten the time （10-15 seconds aregenerally used）. 5. Preparecells in lysis buffer and sonicate for 3, 6, 9 （or whatever you prefer） pulsesand check DNA on gel. Other things to watch out:Load 1 x 105 cell equivalent （This is 0.7 ugDNA）/Lane. Make sure you digested all the RNA （The big smiley band） Load non-sonicated DNA in one lane.20. 什么是reChIP技术？ChIPreChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是，因为 通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少，所以在分析时通常要把