CB966700G多能干细胞定向分化的表观遗传学调控网络Word文件下载.docx

1、换而言之，组织特异性的信号因子、转录因子和RNA分子是如何作用于表观遗传酶机器，引导其建立细胞类型特异性的表观遗传修饰图谱？一旦图谱建立，细胞特有的表观遗传修饰图谱是如何解读的？即细胞特有的表观遗传修饰图谱是如何决定基因表达和细胞谱系命运的？多能性干细胞受内、外信号的影响而选择不同命运。那么，多能干细胞在分化成不同组织类型的细胞过程中，表观遗传调控网络有何异同？另外，细胞培养并不能完全反映个体发育的规律。那么，同组织类型的细胞在体外分化和体内个体发育过程中的表观遗传调控网络有何异同？虽然小鼠是研究干细胞分化和哺乳动物发育极佳的模式动物，但是干细胞在再生医学中的应用需要对人类的组织细胞分化有很好

2、的认识。那么，从进化角度来看，表观遗传调控网络在人和小鼠等物种间有何异同性？如何指导人类多能干细胞在体外高效定向分化为近似于体内发育的各种功能细胞，并促进它们的功能成熟及提高修复损伤器官的能力？寻找这些关键科学问题的答案，将加深对干细胞定向分化和生命个体发育调控规律的认识，为建立能应用于再生医学的定向分化技术体系奠定基础。、主要研究内容围绕以上科学问题，我们以表观遗传学调控为中心，综合运用遗传学、分子生物学、生物化学、蛋白组学及基因组学等系统生物学技术，对体外和体内干细胞分化过程展开系统、深入的分析。首先，以多能干细胞向包括神经外胚层、心血管中胚层等体细胞和生殖细胞的分化为模型，在已建立的分化

3、体系的基础上，利用报告基因分离出高纯度的各分化组织细胞系。在以上不同的分化过程中，构建以表观遗传因子为中心的分子调控网络，解析单细胞及多细胞的全基因组表达谱和表观遗传修饰谱，研究信号通路、转录因子、非编码RNA和表观遗传因子之间的相互作用，以及这些互作对基因表达和细胞命运的影响。这些以表观遗传因子为中心的蛋白-RNA-DNA相互关联的机制及其对全基因组转录谱的影响作用，我们通称之为表观遗传调控网络。我们将不仅从宏观系统水平上认识分化过程中的表观遗传学、转录和转录后调控，而且从分子水平上深入研究几个关键转录因子、表观遗传学酶机器、microRNA和长链ncRNA对以上分化过程的影响。通过对不同分

4、化系统的比较，了解不同组织器官的细胞谱系是如何被确立的，寻找影响定向分化的共通的和特异的调控机制。利用报告基因、基因敲入和敲除的小鼠模型，研究表观遗传调控在体内组织发育中的作用。通过从分化组织细胞类型、动物体内外和物种进化三个维度上比较表观遗传调控网络的异同，鉴定出影响多能干细胞定向分化的关键调控机制和调控分子。最后研究如何操控以上关键调控因素，获得高效、安全地诱导多能干细胞分化为神经、心血管和生殖细胞的新手段，为实际应用奠定基础。二、预期目标、总体目标本项目将建立一支高学术水平的研究团队，充分利用人和小鼠在体内和体外研究系统的优势和互补性，重点研究多能干细胞向三种不同模式细胞分化的以表观遗传

5、调控为中心的分子机制。在多细胞或单细胞水平上，解析多能干细胞向三种不同模式细胞分化的、细胞特有的调控因子与表观遗传因子间相互作用的图谱，解析全基因组表达谱和表观遗传修饰谱，构建以调控因子与表观遗传因子的互作为中心的、关联表观遗传修饰和基因表达的表观遗传调控网络，找到控制不同分化方向的调控网络的共通点和特异性，全面系统地认识表观遗传调控对多能干细胞在体内、外及不同谱系分化、发育中的作用。筛选调控上述分化过程的关键调控因子（包括表观遗传因子、非编码RNA、转录因子和信号分子）；通过综合调控若干关键因子来优化各分化体系，为人工操控干细胞命运，建立高效、安全的定向分化手段提供线索，为干细胞疗法的临床实

6、现提供理论和应用基础。在相关领域取得一些理论、方法和技术突破，力争取得具有国际影响的原创性成果；培养高水平研究人才，形成能够持续进行创新性研究的能力；提升我国干细胞基础研究水平和国际影响力，促进我国干细胞和发育生物学学科的发展。、五年具体目标 （）建立人和小鼠多能干细胞 （ESCs / iPSCs）向神经外胚层、心血管中胚层和生殖细胞的分化和纯化体系。（）构建若干基因敲入（knockin） 和报告基因的小鼠模型，为研究在动物体内表观遗传机制对胚胎发育、器官形成的调控提供实验平台。（）绘制并比较体内外各模式细胞的全基因组表达图谱（包括蛋白编码基因、microRNA和长链ncRNA）和表观遗传修饰

7、图谱。（）建立关联蛋白、DNA和RNA 的三维调控网络，并解析细胞特异的调控因子（包括蛋白、长链ncRNA和microRNA）与表观遗传机制的相互作用。（）构建、整合及比较不同分化方向及状态的细胞的表观遗传调控网络，全面、动态地认识细胞命运决定和细胞谱系的特异性与稳定性维护的分子机制。（）找到影响干细胞分化和命运决定的若干关键调控因子（蛋白、microRNA或长链ncRNA）；实现向多巴胺能神经元、脊髓运动神经元、心肌、血管等组织和生殖细胞的高效定向分化。 （）预期在国际主流期刊上（影响因子IF5）发表论文3050篇，力争在国际顶尖学术期刊上（包括Cell、Nature和Science等）发表

8、论文 36篇。（）建立和培养一支具有国际影响力的高水平的干细胞研究梯队，争取培养国家杰出青年基金获得者35名，并申报专利35项。三、研究方案、总体学术思路本项目将以人和小鼠多能干细胞及小鼠体内干细胞为模型，来探讨生物发育和细胞分化的内在规律，并利用这些规律建立高效、安全的干细胞定向分化体系（如图1）。图1、总体学术思路我们将对多能干细胞分化成的三种模式细胞谱系进行研究，包括神经外胚层和心血管中胚层在内的两类体细胞以及生殖细胞。利用并优化现有的分化手段来建立分化的模式细胞系，研究和比较它们在未分化及分化状态下的信号通路、转录、转录后和染色质水平上的调控，建立以表观遗传调控为中心的涉及蛋白、DNA

9、和RNA 相互作用及转录表达的四维调控网络（通称为表观遗传调控网络）。同时，我们将建立报告基因与基因敲入、敲除的小鼠品系，通过分离体内干细胞, 从个体发育的角度深入研究以表观遗传调控为中心的调控网络如何控制动物体内的神经、心血管和生殖系统细胞的形成。比较不同分化系统和体内、外发育模型的表观遗传调控网络，找到控制多能干细胞向不同方向分化的机制的共通点和特异性。不仅要找到更多控制细胞命运的关键因子，包括转录因子、microRNA、ncRNA和表观遗传因子, 并且全面综合地认识它们如何作用于表观遗传学修饰机制，影响转录表达，最终决定细胞谱系及功能。通过比较人与小鼠同类细胞分化过程中的调控机制的异同,

10、 从进化的角度理解这一调控网络的演变。本项目的立项将为我们人工操控细胞命运提供新的线索和理论依据，并将最终促进细胞疗法的临床运用。、技术途径我们将利用最前沿的技术平台，结合现代分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、发育生物学及系统生物学方法，全面系统及深入地认识控制多能干细胞向不同方向分化的分子及表观遗传机制。依据体内组织器官发生的规律，我们将诱导多能干细胞分化为神经、心血管和生殖细胞，通过组织特异性荧光蛋白报告细胞系及表面抗原，分离纯化各分化阶段的神经、心血管和生殖细胞，初步建立一个稳定的高效诱导分化方案，为研究分子机制提供细胞基础。PRC2主导的H3K27的三甲基化（H3K27me3）

11、代表一类重要的表观遗传抑制机制。它们调控几乎所有与干细胞增殖和分化相关的发育过程，包括神经、心血管及生殖器官的形成，对ESCs的分化起不可缺少的作用。因此，我们将以PRC2为中心，研究表观遗传学调控在多能干细胞定向分化和胚胎发育中的作用。我们将用一种新的手段，利用生物素（biotin）和FLAG双标计内、外源的PRC2, 来对PRC2复合物进行蛋白质组学（tandem protein complex purification coupled with mass spec microsequencing）、基因组学 （RNA-seq、ChIP-seq和RIP-seq）、分子及细胞、生物化学的分析

12、。我们首先利用人和小鼠ESCs的分化模型，研究PRC2在神经、心血管和生殖系统中如何与蛋白、RNA和DNA结合和相互作用。在利用体外细胞培养的同时，我们将建立基因敲入的（knock-in）小鼠品系，表达受内源启动子控制的生物素 （biotin） 和FLAG双标计的PRC2蛋白, 为研究动物体内胚胎发育、器官形成的分子机理提供实验平台。此外，利用我们在小鼠PRC2表观遗传学和microRNA系统方面的优势，我们将建立一系列转基因小鼠品系，使它们既有神经、心血管或生殖细胞特异性荧光蛋白报告体系，也同时表达带标记的PRC2组分或条件性microRNA全敲除系统，研究表观遗传调控和microRNA在体

13、内发育中的作用。对以上体外、体内不同分化模型及小鼠早期胚胎发育，利用单、多细胞microRNA和转录组分析技术（single-cell RNA-seq），全面分析多能干细胞在体内、外定向分化过程中全基因组水平的蛋白编码基因、ncRNA和microRNA的表达。利用ChIP-Seq技术分析重要表观遗传修饰谱（包括H3K27me3）。此外，我们将对几个在神经、生殖系统特异表达的RNA结合蛋白（包括Musahi、HuD、FMRP、PELOTA、DAZL和VASA等）进行RNA免疫共沉淀和高通量测序分析（RIP-seq），来筛选调控神经、生殖系统分化的重要ncRNA, 阐明它们的生理功能。通过分析不同

14、分化阶段各类细胞的mRNA、microRNA和ncRNA表达谱、PRC2靶区域和结合蛋白及ncRNA，以及表观遗传修饰谱，利用系统生物学网络构建的方法，整合以上信息，建立以表观遗传调控为中心的涉及蛋白质、DNA和RNA 相互作用及转录表达的四维表观遗传调控网络。从宏观系统水平上全面、动态地认识信号通路、转录因子、非编码RNA和表观遗传因子之间的相互作用，它们如何介导表观遗传学酶机器PRC2的募集和表观遗传标记的建立，以及这些互作对基因表达和细胞命运的影响。构建在不同分化系统和体内、外发育模型的表观遗传调控网络，通过比较这些网络，认识它们的共通点和特异性，寻找影响定向分化的网络中心或节点，筛选出

15、更多的控制细胞命运的关键因子，包括信号因子、转录因子、microRNA、ncRNA和表观遗传因子。结合过表达、RNA干扰及基因敲除等技术，研究关键因子在分化过程中的功能及它们与表观遗传机制的相互作用。包括转录因子、microRNA和ncRNA是如何控制表观遗传机制来建立特定的表观遗传状态，而表观遗传机制又是如何调控转录表达的。通过比较人和小鼠多能干细胞分化过程中转录因子、microRNA和表观遗传机制互作网络的异同, 从进化角度深入理解表观遗传为中心的调控网络在干细胞分化过程中的作用。最后，我们将把研究成果转化到人类ESCs定向分化的体系中, 优化培养条件，利用mRNA 转染、化学小分子诱导等

16、先进技术，争取最大限度地提高人类多能干细胞向各种神经、心血管和生殖组织定向分化的效率和安全性，并通过动物移植模型验证分化细胞的功能。3、课题设置本项目运用人和小鼠的多能干细胞，构建及比较不同分化系统和体内、外发育模型的表观遗传调控网络，从系统和分子水平上研究控制多能干细胞向不同方向分化的分子机制，通过认识调控机制的共通点和特异性，找到更多控制细胞命运的关键因子，并且深入研究它们如何作用于表观遗传修饰机器，影响转录表达和最终决定细胞谱系及功能。最后，研究如何通过操控决定细胞命运的关键因子或机制，提高人类多能干细胞向各种神经、心血管和生殖细胞分化的效率和安全性。基于这样的思路，同时考虑项目团队成员

17、的研究方向的共性，我们设置四个课题： （）多能干细胞向体细胞（包括神经外胚层及心血管中胚层）分化模型及调控机制；（）多能干细胞向生殖细胞分化模型及调控机制；（）表观遗传学调控在干细胞定向分化中的作用；（）转录及转录后调控在干细胞定向分化中的作用。图2、各课题间相互关系课题、将建立和优化多能干细胞向三类组织细胞分化的培养体系（图2）。课题、不仅为课题、提供分化的细胞模型去研究分化过程中的分子及表观遗传学调控，同时也有自己在机制研究上的侧重点。课题、侧重于利用系统生物学方法，为课题、的研究提供机制和提出生物学假设，使其在分子水平上得到验证。并且，课题、的基因敲入和敲除的小鼠模型将与课题、的荧光报告

18、基因小鼠杂交，从个体发育的角度研究表观遗传调控如何控制动物体内组织器官的形成。并且, 课题、的研究内容应该是表观遗传调控路线中的上下游的关系。课题主要集中表观遗传状态是如何建立的，即在分化过程中细胞特有的调控因子和表观遗传酶的相互作用；而课题主要集中在广义的表观遗传调控机制，涉及到对表观遗传状态的解读，即表观遗传状态如何调控基因转录（转录组）。通过对课题、研究结果的整合，我们构建出影响干细胞分化和细胞谱系命运的表观遗传调控网络。课题、研究的分化系统之间，也存在信号分子、RNA 结合蛋白、microRNA和表观遗传调控机制上的共同点。通过对不同分化系统的比较，我们才能更好地认识调控机制上的共通性

19、和特异性。我们希望通过操控向不同谱系分化的共通的关键调控机制，来提高定向分化效率；通过操控不同谱系分化的特异性的关键调控机制，来控制定向分化方向。因此，这四个课题形成有机整体，对我们综合认识干细胞在体内、外及不同模式动物中的分化机制是缺一不可的。4、工作安排本课题承担单位为清华大学和北京大学和中科院动物所。具体分工和经费分配如下:课题1：多能干细胞向体细胞（包括神经外胚层及心血管中胚层）分化模型及调控机制；负责人: 那洁, 副教授, 清华大学学术骨干: 沈沁，教授，清华大学张荣利，副教授, 北京大学预算经费： 24%课题2：多能干细胞向生殖细胞分化模型及调控机制； 韩春生, 研究员, 中科院动

20、物所 纪家葵，教授，清华大学课题3：表观遗传学调控在干细胞定向分化中的作用； 沈晓骅, 教授, 清华大学 刘晓玲，高级工程师，清华大学夏永静，副教授, 清华大学 25%课题4：转录及转录后调控在干细胞定向分化中的作用。 汤富酬 , 教授, 北京大学 汪阳明，教授，北京大学刘晓颖，讲师, 北京大学 27%那洁副教授和沈沁教授将分别负责多能干细胞向心血管和神经分化方面的研究。两实验室将合作建立转基因小鼠平台，分离体内发育的各阶段，各类型心血管和神经细胞。那洁副教授和张荣立副教授将合作在动物模型上验证分化细胞的损伤修复功能。纪家葵实验实验室将集中精力于将人的ESCs分化为PGCs，而韩春生实验室将集

21、中力量获得从多能性细胞来的SSCs。两个研究组将合作建立从多能细胞到生殖细胞的更加高效安全的诱导方案和机理研究。沈晓骅教授致力于系统解析PRC2介导的表观遗传学调控在干细胞定向分化中的作用，负责多能干细胞系和knockin质粒的构建，及表观调控网络的构建。刘晓玲高级工程师负责建立和维持knockin小鼠，及建立转基因小鼠平台，包括拥有报告基因和双标记基因敲入的小鼠模型或microRNA全敲除的小鼠模型。夏永静副教授负责利用以上细胞和小鼠模型向心血管、神经和生殖分化方面的研究。汤富酬教授负责解析人和小鼠胚胎干细胞定向分化过程中的转录组及表观遗传组，及对关键转录因子的功能和它们与表观遗传因子和网络

22、的相互调控。汪阳明教授负责研究人和小鼠胚胎干细胞定向分化过程中microRNA组学分析与其功能，及microRNA与表观遗传因子和网络的相互调控。以上科研工作者在课题分属的研究内容中均在国内外做出过突出的成绩，实验室均有良好的研究条件，包括硬件设施和软件支撑，能够保证课题的正常进行。科研成果形成论文将公开发表在知名杂志，关键技术将申报专利。5、创新点与特色（） 参加项目的各个课题组，近几年来在干细胞研究方面积累了丰富的研究经验和前期工作基础，在干细胞相关研究领域居国际领先地位。并且，本项目整合各实验室的特长，组织了干细胞基因调控研究方面的专家，包括表观遗传学（沈晓骅）、表观遗传和基因组学（汤富

23、酬）和非编码RNA（汪阳明），与干细胞信号传导（那洁）、神经干细胞（沈沁）和生殖干细胞（纪家葵，韩春生）研究方面的专家。因此，我们是一支优势互补的团队。重要的是，我们会做到真正的交流、合作、互补与共同发展。我们将建立一个包括人和小鼠多能干细胞在体内、外向神经、心血管和生殖细胞分化的相关数据库。该库包括以下几个内容：分化体系；全转录组，包括蛋白编码基因、microRNA和长链ncRNA的表达图谱; 表观遗传学图谱，包括H3K27me3、H3K4me3等标记图谱；蛋白关联网络，包括PRC2的关联蛋白；蛋白 RNA 的关联网络，包括PRC2的关联ncRNA 。各组在自己的研究系统内开展工作，不断更新

24、及共享数据库，并探寻其它系统中与自己兴趣相关的新的突破点。通过统一规划，联合攻关，与定期的学术交流（比如每月召开一次大组会议），各组之间可以在第一时间内了解其它组的工作进展，从而避免了单枪匹马的孤军作战，增强我们在国际竞争中的优势。（）本项目以发育生物学基本原理为基础，不仅从宏观系统水平上动态认识分化过程中的以表观遗传学为中心的调控网络，而且从分子水平上深入研究转录因子、表观遗传学酶机器、microRNA和长链ncRNA对多能干细胞定向分化的影响。从而了解细胞谱系在不同组织器官是如何被确立的，寻找影响定向分化的共同和特异机制，并着重于关键调控因子的鉴定。有的放矢地设计出提高分化效率和操控细胞命

25、运的最佳方案。（）我们已建立了一个非常成熟的用生物素和FLAG标记PRC2各核心组分的ESCs实验手段。利用生物素（biotin）与链霉亲和素（streptavidin）的高度特异性及极强的亲和作用，结合高通量蛋白质及DNA测序技术，我们有一个极好的实验平台去揭示在全基因组范围内所有与PRC2相互作用的蛋白、microRNA与长链ncRNA分子。并且，通过构建基因敲入（knockin） 小鼠模型，将生物素FLAG 双标记通过同源重组整合到内源编码PRC2 组分的基因组位点上，为研究在动物体内表观遗传机制对胚胎发育、器官形成提供实验平台。（）单细胞分析是本项目的特色之一。由于分化、发育过程中细胞

26、的异质性（Heterogeneity），单纯的大量细胞平均分析（Ensemble Analysis）会损失关键的基因表达调控信息。在本课题中，我们将利用我们自己最近发展的单细胞数字转录组分析技术（RNA-Seq），对多能干细胞在体内、外原初分化过程中的基因表达变化进行单细胞分辨率的、全转录组范围的分析，获得基因表达调控网络的精确定量信息。同时，我们正在建立及完善少量细胞ChIP-Seq和RIP-Seq技术。将单细胞转录组分析与表观遗传组分析结合起来，我们将突破简单的基因表达现象描述以及简单的表观遗传组现象描述，利用最新的技术手段，研究多能性细胞分化发育过程中关键表观遗传密码对于核心基因表达网络

27、的调控机理。（）我们已建立可microRNA全敲除的ESCs和小鼠模型，为寻找在干细胞分化过程中起关键作用的microRNA 提供了实验基础和手段。这一模型避免了因microRNA表达的饱和性（saturation）和冗余性（redundancy）对研究microRNA功能所造成的技术性困难。本项目侧重于研究microRNA与表观遗传因子之间的相互调控这一尚未充分研究的领域，以此作为一个突破口来探讨表观遗传修饰建立的机制，并且为完善ESCs的定向分化提供新的靶点和技术。（）我们是世界上率先使用RNA转染技术进行细胞重编程的团队之一，在这项新技术的应用上已积累了很多经验。相比DNA，病毒或蛋白质

28、的技术，RNA技术有简单直接，高效可控，不改变基因组等优点，这决定了它在细胞治疗和再生医学中将会有广泛应用。本研究进一步开发RNA 转染技术在干细胞定向分化中的应用，以提高分化细胞生成效率和安全性。6、可行性分析研究如何诱导多能干细胞分化为具有独特功能的各种成体细胞是国际干细胞和再生医学领域的研究热点，但也是研究难点。尽管科学家们已投入了大量的精力去尝试各种生长因子和细胞因子的组合培养体系使多能干细胞在体外特定条件下分化为各种类型的细胞，但是分化方向很难控制，分化效率低，并且所得到的细胞往往缺乏正常的生理功能。因此，这一问题的解决依赖于对干细胞在定向分化过程中的调控机制的全面深入解析。个体发育

29、和干细胞分化过程的本质就是在不同类型的细胞中建立不同的表观遗传图谱。因此，系统解析以表观遗传学图谱的建立、维持、识别和解读机制为中心的分子调控网络，是认识干细胞分化和个体发育的关键所在，也是最有可能产生突破性发现的研究方向。近几年来，本项目的主要参加人员在多能干细胞的表观遗传机制（沈晓骅）、转录和转录后调控（汤富酬、汪阳明），与多能干细胞的定向分化（沈沁、那洁、纪家葵、韩春生）方面做了大量扎实的工作，已经积累了丰富的实验经验和大量前期实验结果，并获得了多项具有国际影响的研究成果。在此基础上，我们将研究进一步集中在以表观遗传调控为中心的分子调控网络这个方向上，使用最前沿的科学技术手段，综合运用各

30、种生物学和系统生物学技术，对体外和体内干细胞分化过程展开系统、深入的分析，因此取得重大突破性成果的可能性是很高的。这样实质性的合作研究是单个研究体系、单个实验室所难以企及的。四、年度计划第一年研究计划1、 运用不同的生长因子和信号分子组合，定向诱导多能干细胞向心血管、神经和生殖细胞分化，建立和优化分化培养体系；2、 制作一系列转基因细胞系，带有心血管、神经或生殖细胞组织特异性报告基因（比如Mesp1、Nkx2.5、Islet1、Six3、Pax6、VASA和Dazl驱动表达的荧光标记），纯化不同分化阶段的心血管、神经及生殖细胞；3、 利用组织细胞特异性CRE小鼠（如Mesp1-CRE、 Mef

31、2C-CRE、 MHCa-CRE、 Pax6-CRE、TH-CRE等）与双色荧光Flox转基因小鼠杂交，分离体内发育的各阶段不同类别的心血管、神经及生殖细胞；4、 分离小鼠早期胚胎发育过程中的上胚层、外胚层、中胚层和内胚层细胞，优化单细胞高通量测序技术（single-cell RNA-Seq），对以上分离纯化的、体内外各组织类型细胞，进行单/多细胞cDNA和microRNA文库的构建；5、 建立人和小鼠ESCs系稳定表达生物素（biotin）和FLAG双标记的表观调控蛋白（比如PRC2复合体组分包括EED、EZH2、EZH1、JMJ 和 MTF2）；建立生物素（biotin）和FLAG双标记基因敲入（knockin）的E