湿热灭菌工艺验证指南Word下载.docx

1、 在饱和蒸汽中, 温度与压力之 间存在固定的关系。 饱和蒸汽的加热速度较快, 这是因为蒸汽在灭菌过程中相变放出了大量 潜热; 对于大型的软包装产品或玻璃瓶产品而言, 过热水喷淋灭菌的方法应用十分普遍, 在 此灭菌方式中, 不存在蒸汽的相变, 热量的转移依赖于过热水的强制运动及与被灭菌品的直 接接触。蒸汽 -空气混合物灭菌中,单位体积所包含的热容量较低,灭菌腔室压缩空气和蒸 汽的比例,需根据产品和所用的包装材料作必要的调整。目前常用的脉动真空灭菌器, 又称预真空灭菌器, 是饱和蒸汽灭菌的一种特定方式, 其 基本手段是在排除灭菌腔室中影响灭菌效果的不凝气体后,再通入饱和蒸汽进行灭菌。 本指南有关湿

2、热灭菌过程及参数的术语如下, 在不同的文献中, 同一术语的含义可能有 所不同:1. 初始菌（Bioburden 又称生物负荷,即灭菌前原材料、部件、或包装等物品上所带有存活微生物的总数。2. 生物指示剂（Biological Indicator接种已知数量微生物用于测试湿热灭菌工艺实际效果的产品。3. 腔室冷点（Chamber Cold Spot指在灭菌过程中,装载区中 F 0或温度最低的位置。4. 化学指示剂（Chemical Indicator化学指示剂是能展示一个或多个预定工艺变量的测试系统。 化学指示剂不能证明产品是 否无菌, 它们只能说明产品是否灭过菌, 所以在湿热灭菌的验证中, 化

3、学指示剂不能代替生 物指示剂和温度 /压力等的仪器测试。5. D（Decimal Reduction值微生物耐受参数,系指在一定温度下,使微生物的数量减少一个数量级或 90%所需要 的时间。 D 值越大,说明该微生物的耐热性越强。不同的微生物在不同的环境条件下（如不 同的灭菌温度、不同的介质环境可能具有各不相同的 D 值。在湿热灭菌中, D T 系指微生物 在灭菌温度 T 下的 D 值。一些文献中,如不是特指的其它灭菌温度, D 的测试温度通常可 理解为 121。6. 蒸汽的干燥值（Dryness value系含水蒸汽中蒸汽的测量值。干燥值为 100%即是饱和蒸汽。蒸汽的干燥值与它具有的 潜热

4、直接有关,如干燥值为 0.5时,表示蒸汽和水的比例为 50:50,其潜热量只有饱和蒸汽 的 50%。7. F值（F-value, Lethality Factor,或 Process Lethality 指灭菌效力的度量值。 F （T, Z 是在规定的 Z 值下, 一个灭菌程序赋予一被灭菌物品在参照 温度 T 下的等效灭菌时间,简称 T 灭菌时间。实验数据表明, 在湿热灭菌中, 微生物死亡遵循一级动力学反应。 灭菌程序的杀灭效果 是灭菌温度 T 下,微生物耐热参数 D 和灭菌时间 FT T的函数。微生物的存活曲线可以用下面的 半对数式表示: 式中N F :被灭菌物品在灭菌 F 分钟后,微生物的

5、残存数量;F （T,Z :在温度 T 和该温度 Z 值条件下,灭菌程序经计算的杀灭力,以 T 下的时 间（分钟表示;D T :微生物在 T 和 Z 值下的耐热参数;N :灭菌程序开始前,物品的初始菌数量。F phy 系指以灭菌工艺的物理参数为基础的物理杀灭力,它与灭菌温度、 Z 值相关。在同一 湿热灭菌程序中,灭菌率 L 是灭菌温度的函数。 L （灭菌率和 F phy （物理杀灭力的计算式 分别如下:或灭菌过程的温度-时间曲线图 1 灭菌过程温度 -时间曲线与 F 关系图0上式中, t 1表示灭菌过程中产品升温达到 100的起始时间, t 2是产品冷却至 100（灭 菌保温阶段结束的时间, t

6、 是记录灭菌温度的间隔时间。 （100以下对 F 0值影响极小,可 以忽略 。F BIO 系指灭菌过程的生物杀灭力。它可通过指示剂挑战试验或微生物实际杀灭试验中求 得。生物杀灭力的计算公式如下:上式中, N 0为初始菌数, N F 是灭菌后的残存菌数, D 为下降一对数单位所需的时间。F 0值（标准灭菌时间 ,是指 Z 取 10时,一个湿热灭菌程序赋予被灭菌品 121 下灭菌 的等效灭菌时间。例如,某产品在 117灭菌 20分钟或 115灭菌 32分钟的灭菌效果均相 当于 121下灭菌 8分钟。8. 阴性分数法（Fraction-Negative Methods指取生物指示剂的起始值（N 0及

7、有序灭菌的数据来建立一条二点的直线,以此确定 D T 值的方法。此方法必须采用一组试样,经有序加热后,获得相反结果 -一些样品为阳性, 另一些样品为阴性,然后按阴性样品的比例数计算 D 值。9. 热穿透（Heat Penetration热穿透试验是一个用以评估热量已经转移到被灭菌品的测温试验。为了测试热量的穿 透,应将测温探头放置在需评估的装载上（或装载物品中间 。10. 杀灭率（Lethal Rate指某一温度下灭菌 1分钟与 121下灭菌 1分钟的比值, 即某一温度下灭菌一分钟所相当的标准灭菌时间,以 L 表示（参见术语 6 。11. 湿热（Moist Heat系指用于灭菌的蒸汽、蒸汽 -

8、空气混合物以及过热水。12. 不冷凝气体（Noncondesable Gases指在灭菌条件下不会冷凝而释放潜热的空气及其它气体。13. 运行参数（Operating Parameters共同界定灭菌程序每一阶段（如抽真空、升温、保温、冷却且需加以控制和 /或测试 的数值（如压力、温度、时间 。关键参数（Critical Parameters :指与产品安全及有效性相关,需加以控制和 /或测试的 数值,关键参数失控应直接导致装载报废的结果。重要参数（Key Parameters :用以确保运行中灭菌过程处于“受控状态”而需进行控制 和测试的数值。 任何重要灭菌工艺参数不符合标准, 应进行调查,

9、 并有说明装载处置合理性 文件和记录。14. 过度杀灭程序（Overkill Approach一个对产品生物负荷信息要求很低的灭菌程序, 即用一个假设的最差的状况, 来确定被 灭菌品非无菌的概率小于 10-6的程序 -要求 F PHY 和 F BIO 均大于 12分钟的程序。15. 预真空程序（Prevacuum Process以真空手段排除灭菌腔室中空气后再进入灭菌阶段的灭菌程序。 此程序特别适用于对包 藏或夹带空气的物品,如织物、胶管、过滤器和灌装机部件等的灭菌。16. 灭菌工艺性能确认（Process Performance Qualification也称为验证, 系指有文件和记录证明一

10、个灭菌系统在规定的运行环境条件下, 能够始终 如一地按预期要求完成并控制灭菌工艺的一系列活动。17. 饱和蒸汽（Saturated Steam又称干蒸汽, 系指与水蒸发曲线的温度与压力相应的蒸汽, 即处在汽液平衡状态但不夹 带液体水的蒸汽。18. 蒸汽-空气混合气体（Steam- Air Mixture灭菌以饱和蒸汽 -空气混合气体为加热介质的灭菌方式。空气的作用主要是平衡灭菌过程密 封容器中的空气膨胀及药液汽化产生的内应力, 尽可能减少冲盖、 炸瓶、 软包装容器形变等 质量风险,提高最终产品密封的可靠性。为了防止被灭菌装载中形成冷点, 减少蒸汽损耗, 灭菌过程必须保持蒸汽和空气混合物 气体的

11、不断循环。19. 灭菌（Sterilization 用以去除产品中活的微生物并使其达到规定存活概率的处理过程。20. 无菌保证水平（Sterility Assurance Level, SAL产品 /物品经灭菌后微生物残存的概率。该值越小,表明产品中微生物存在的概率越低。 为了保证注射剂的无菌安全性,采用湿热灭菌法的产品,其 SAL 不得大于 10-6,即灭菌后微 生物存活的概率不得大于百万分之一; 而采用无菌制造工艺生产的产品, 如冻干或无菌分装 的产品,其 SAL 一般只能达到 10-3的水平。21. 灭菌程序（Sterilization Cycle一个使某一物品达到无菌所需条件及规定运行

12、参数（如时间、温度和压力的程序。22. 过热水程序（Superheated Water Process也称过热水喷淋灭菌程序, 是在空气加压条件下, 通过循环泵强制过热水循环, 持续与 被灭菌产品进行热交换的灭菌方式。此程序中,加压的作用不但是保持循环水不发生汽化, 而且要维持被灭菌产品包装容器内外压力的平衡,以防止冲盖或包装变形等产品缺陷。23. 验证（Validation 一个能够科学地确保生产工艺生产出合格产品的有文件和记录证明的程序。 验证的 证据应通过验证方案的合理设计及对验证结果的科学、 全面的分析和评估获得, 这一过程最 好始于工艺的开发阶段,持续地进行,直至商业化生产。24.

13、灭菌温度系数（Temperature Coefficient, Z value使 D 值变化一个对数单位温度需调整的度数（ 。四、湿热灭菌基础4.1湿热灭菌的机理湿热灭菌是研究最深、使用最广的灭菌方式。当温度超过细胞最佳生理活动的温度范围 时,随着温度的升高,细胞代谢减缓,细胞的生长及繁殖最终停止。每种细胞对温度的耐受 性均有一上限,一旦温度超过它的上限,起生命作用的蛋白质、酶及核酸会被永久性破坏, 从而导致细胞发生不可逆转的死亡。简言之,从机理上说,在湿热灭菌中,芽孢的死亡属蛋 白质的变性,所需灭菌温度较低。与此不同的,干热灭菌从机理上说则属于氧化,因此,所 需灭菌温度要比湿热灭菌要高得多。

14、4.2影响芽孢耐热性的因素细菌芽孢的耐热性与很多因素相关, 这些因素尚未完全弄清。 芽孢形成时, 细菌停止生 化反应,并将遗传物质包藏在芽孢中。此期间发生了一系列生理变化:细胞质大量脱水,体 积变小,并在缩小的原生质体周围形成一层厚壳。此外,还会形成一种名为吡啶二羧酸或 DPA （吡啶 -2,6-二羧酸的特殊化学物质。芽孢形成阶段,吡啶二羧酸钙与 DNA（脱氧核糖 核酸 以及细胞内的酶形成复合物,它们能保护处于休眠状态的芽孢。芽孢可以在休眠状态 下存活多年, 有的可存活上百万年, 一旦出现有利于芽孢适于繁殖的条件, 它便可在几分钟 内恢复到生长状态。 在湿热灭菌中, 了解影响微生物耐热性的因素

15、对设计灭菌程序、 验证及 日常监控十分重要,现对主要的影响因素简要说明如下:在细菌芽孢形成期, 环境因素影响芽孢的耐热性。 例如, 温度较高并有二价阳离子 （如 Ca 2+2+、 Fe 、 Mg 2+、 Mn 2+存在时,芽孢的耐热性增强;在另一些条件下,如当 pH 值超出 6.0-8.0的范围时,或在高浓度的盐水或磷酸盐中形成芽孢时,芽孢耐热性下降。自然界中芽孢的耐热性还与环境条件相关,如溶液浓度、水份（相对平衡湿度 a 、 pH 值、 对芽孢有损伤作用的物理因素以及对芽孢有抑制作用的化学品等, 它们均会影响芽孢的 耐热性。包藏在晶体或有机物内的芽孢,其耐热性通常明显高于一般非包藏态芽孢。因

16、此,在某 一温度条件下, 将泥土包藏性芽孢和从泥土培养得到的芽孢同时灭菌时, 要想获得相同的灭 菌效果,前者所需的灭菌时间是后者的十倍。理解这一点,有它的现实意义,因为待灭菌品 要是受到了泥土中芽孢的污染 （如在运输处理中被未经过滤空气的微粒所致的污染, 或者由 人员或其它物品接触所致的污染 ,则很难被完全杀灭。换言之,药品生产企业的 HV AC 系 统设计和维护, 物料、 容器、 工器具等的清洗及处理, 对灭菌的安全性起有十分重要的作用, 湿热灭菌的安全性不能只局限于产品的最终灭菌。在热力灭菌中,水对杀灭细菌芽孢起着重要作用。与水相关的灭菌方式只有两种:湿热 和干热。湿度达到饱和条件下 相对

17、湿度 （RH, relative humidity为 100%（或 a w =1.0 的灭 菌方式称为湿热灭菌;相对湿度低于 100%条件下的灭菌方式统称干热灭菌。有证据表明, 温度在 90125之间,相对湿度在 2050%时,细菌芽孢的耐热性强 , 较难杀灭;当相对 湿度高于 50%或低于 20%时,芽孢的耐热性迅速下降,比较容易杀灭。人们普遍认为湿热灭菌之所以有效, 是在于热使细胞内的起生命作用的蛋白质和酶发生 变性或凝固。 水分对灭菌有促进作用, 湿热灭菌所需的温度低于干热灭菌所需的温度, 是这 一论点的依据。4.3湿热灭菌中的能量转移温度是热能的度量。热量是物体及其周围环境之间因温差而

18、发生能量转移的结果。 对于适宜采用湿热灭菌方式的产品或物品而言,湿热灭菌不失为一种十分经济而又有 效的方法。饱和蒸汽灭菌是湿热灭菌中最常见的方式。饱和蒸汽灭菌、过热水灭菌（喷淋、 直接浸泡 /过热水旋转灭菌等,发生着多种形式的能量转移,包括传导、对流和辐射。在湿 热灭菌中能量（热能通过容器壁,传给被灭菌药液,或通过灭菌介质（蒸汽或过热水直 接接触传给被灭菌品,这种形式属热传导。饱和蒸汽和过热水特性参见第十章附表 3.饱和蒸汽灭菌中,能量的转移主要依靠蒸汽的相变。当水由液态变成汽态时,需要吸 收大量的热能（汽化热:540卡 /克 。在灭菌过程中,当蒸汽接触到温度较低的物体时,就 会释放 540卡

19、 /克的潜热,生成冷凝水,直到物体的温度与蒸汽温度相等。这个高效的热传 递方式, 是其他任何方法无法相比的。 在预真空灭菌程序中, 无论是高真空或脉动真空灭菌, 虽然在灭菌的初期尽可能的排除了腔室及被灭菌物品 （如过滤器、 衣服、 口罩、 灌装机部件、 软管等 的空气。 但这并不意味着已排除了妨碍灭菌的全部障碍, 冷凝水及时而通畅的排放,和排除空气同样重要,冷凝水如不及时排放,将大大影响蒸汽灭菌的效果。过热水灭菌过程中,能量的转移主要靠过热水的质量（mass ,携带热量的大量过热水 与被灭菌产品直接接触,通过容器壁,将热能传递给容器中的内容物并杀灭其中的微生物。 因此,为了使灭菌的获得良好的均

20、匀性,喷淋循环是十分必要的。有数据表明,在过热水喷 淋灭菌过程中, 装载对灭菌程序的影响较小, 如果不是旋转式菌器保持旋转平衡的需要, 则 不需要采用替代品将灭菌器装满后按满载灭菌程序来处理。要提高灭菌的效果,就必须特别关注灭菌设备的安装、灭菌程序设计,这也是湿热灭 菌验证成功的必经之路。4.4湿热灭菌中微生物杀灭的数学模式本节拟对灭菌程序的设计、开发、确认和验证所采用的基本科学手段作一概述。实验表明,在恒定的灭菌条件下,微生物（只指芽孢的死亡遵循一级动力学规则。芽 孢的杀灭率（体现为残存曲线是耐热性的函数,与芽孢的数量无关。采用内生芽孢（生物 指示剂 BI 的悬浮液或放在载体形式的芽孢进行灭

21、菌试验的结果表明,在湿热灭菌中,半 对数规则适用于芽孢的灭活过程。因此,残存曲线可用如下的一级方程式来描述:Log N F = Log No -F （T,z/DT式中,N 挑战微生物灭菌 F 分钟后的残存数FNo 灭菌前微生物的数量微生物在 T 和 Z 值下的耐热参数。注意, D T 中的温度 T 需和 F T 中的温 度相一致。D T在温度 T 和温度系数 Z 值条件下, 经计算获得的湿热灭菌程序的杀 灭力,以 T 下的时间（分钟表示F （T,z微生物杀灭的数学模式的其它计算公式,参见术语第 6条。在恒定灭菌温度下,理想灭菌速率（微生物残存曲线可用下图表述:图 2 理想微生物残存曲线上图中,

22、 D Tz 为 1分钟, 如 T 为 121, Z 取 10时, 本图体现了美国药典在无菌保证中过度杀灭的要求。 N 为 1060,作为被灭菌品的最差状况来处理。 如在 121的灭菌时间 12分钟,则微生物残存的概率将小于 10-6。D T 是半对数残存曲线的斜率的量度值,因此,它阐述了残存微生物与灭菌时间的关系。 某一微生物的耐热性,实际上与对其测试时的生理状态及环境（如 pH 相关。在半对数湿热灭菌模式中, Z 类似于温度系数, 它描述灭菌温度变化对生物指示剂耐热 性的影响,这也是灭菌过程的升温和降温阶段中,计算标准灭菌时间必不可少的参数。 Z 较 大,说明通过提高温度的方式来提高灭菌的有

23、效性收效较小,反之,如 Z 较小,则提高灭 菌温度对杀灭率的影响就比较明显。F 是半对数模式中用以阐述灭菌时间的术语。根据定义, F 值是按某个参照温度来定的, 因此, 它是以等效灭菌时间的形式来表述湿热灭菌的杀灭力。 由于常规灭菌通常不可能是方 形波, 即被灭菌品不可能在瞬间达到所需的灭菌温度, 冷却过程也不可能瞬间降到常温, 此 时, 需要用温度系数 z 值来计算不同温度下的等效杀灭率, 然后再对时间积分求得 F 值。 由于 Z 的引入,对 F 的计算至关重要,因此,本文附录中收载了 Z 的推导文献。0应当指出, 一级反应只不过是用以表述单细胞芽孢死亡动力学经验公式。 它未必适用于 所有的

24、生物指示剂系统, 可采用其它的模式来描述微生物死亡的动力学。 不过, 过于复杂的 公式,难以在生产中采用,这里不再赘述。残存曲线的半对数模式必须满足二个先决条件:1 挑战菌应是均一的（没有其它杂类芽孢2 挑战菌的灭菌条件相同,或能折算成相同的灭菌条件,例如,折算标准灭菌时间半对数模式并不准确地适用于所有的试验微生物, 然而, 据我们所知, 迄今还没有找到 一个数学模式, 能够适用于所有试验微生物。 在工业上能采用的数学模式必须具备以下条件:1 数学模式具有科学性;2 有良好的安全性,即按该模式处理,可保证被灭菌药品的安全性;3 容易理解,便于应用。半对数模式及其图形, 既可直接用于分析试验数据

25、, 也可用于设计微生物控制程序。 这 也是此模式在学术界和工业界获得普遍认可和广泛采用的理由。五、灭菌法选择的基本原则众所周知,药典收载的灭菌方法有湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌、除菌过滤等,液体 产品以最终灭菌方式采用湿热灭菌则是首选的方法。美国药品生产验证指南中中提到了一个十分重要的观点,这就是说,去验证一个不 合理的系统是没有意义的。 本指南认为, 验证的试验是有限的, 不应当将有限试验数据拼凑 成所谓的 “验证报告” , 为一个设计不合理的系统或方法辩护, 从而给产品和患者带来风险。 这一风险管理的理念,在欧盟的灭菌方法决策树及注释中得到了充分的体现。在灭菌方式的选择上,欧盟在药品研发指南注释附录（CPMP/QWP/155/96阐述的基 本原则值得借鉴（参见图 3 。考虑到产品的热稳定性和受热降解等实际情况, 尽管本指南不期望会有很多产品能够采 用 121 15分钟的灭菌程序,但它的基本原则对液体产品灭菌方式的选择有着重要的指导 意义。液体产品灭菌选择决策树 产品是否可以121湿热灭菌15分钟否使用高压灭菌器 121