大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌整合子散布与ESBLs耐药基因的研究Word文档格式.docx

1、 bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM and blaSHV+ CTX+ TEM was %、%、8. 7%、% respectively. Conclusion The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was related with class integron;The integron with antibiotic resistance gene cassette contributes to multidrug resistance in ESBLs-producing strains. 【Ke

2、y words】 antibiotic resistant gene; ESBLs; integron ESBLs是致使革兰阴性菌对-内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制。质粒、转座子和整合子对耐药基因在细菌间的水平转移起着重要作用。整合子可特异性地俘获和表达外源基因盒,并以质粒或转座子为载体在细菌间移动,致使耐药基因的快速和普遍播散。整合子可携带对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺等耐药基因盒。整合子大致可分为类,其中类在捕捉和表达耐药基因中最多见。因此本文通过研究产ESBLs菌株中类整合子的散布和性质,明确菌株的播散趋势,有效监控细菌耐药。由于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是临床最多见的产ESBLs菌,其中C

3、TX-M、SHV和TEM是最多见的ESBLs型别，本文对我院2006年肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的临床分离株,检测类整合子在产TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的散布,明确类整合子在产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的流行和播散中的临床意义。1 材料与方式 菌株来源 281株肺炎克雷伯菌和201株大肠埃希菌均为我院临床标本中分离并按全国统一操作规程1。标本要紧包括血液、尿液、痰和其他分泌物。 仪器试剂 VITEK-2型全自动微生物分析仪、ID-GN 鉴定卡、AST-GN09药敏卡由法国Bio-Merieux公司生产; VITEK 比浊计（V 1210） 由日本生产；PCR扩增仪为美国PE

4、RKIN ELMER公司9600型基因扩增仪；日本三洋MDF型超低温冰箱;德国Hettich公司22R型低温超速离心机;美国水套式恒温培育箱。 菌种鉴定、药敏 所有实验菌株分离纯化后按VITEK-2的利用要求配制成菌悬液和稀释液, 别离填充到ID-GN和AST-GN09卡中, 用VITEK-2仪器自动完成细菌的鉴定和药敏实验。 质控菌株 由卫生部临床查验中心提供的标准菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853） , 药敏质控结果符合NCCLS 药敏质控要求。 15 超广谱内酰胺酶（ESBLs）检测 依照NCCLS 2000年版推荐的纸片扩散表型确证法进行检测。用

5、肺炎克雷伯菌 ATCC700603为阳性对照，大肠埃希菌 ATCC2592为阴性对照。 耐药基因的检测 采纳碱裂解法和蛋白酶K法提取被测细菌的质粒和染色体基因,提取方式依照不同引物设立不同PCR条件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大肠埃希菌别离作SHV型和TEM型阳性对照。 17 质粒接合转移 将产ESBLs菌株和大肠埃希菌培育到对数生长期,按6：1（v/v）接种,37培育,用含头孢噻肟（1g/ml）的培育基挑选接合菌,制备模板用于PCR扩增。 PCR耐药菌基因2 依照GenBank发布的类整合子整合酶基因和blaSHV、blaCTX和blaTEM基因序列，采纳Primer

6、软件设计引物（表1）。反映体系均为25l,其中缓冲液l,10mmol/L 4dNTP l,50mol/上下游引物各1l,DNA多聚酶l,DNA模板1l,超纯水l 。依照不同引物设立不同PCR反映条件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型阳性对照，以TEM-26型大肠埃希菌作TEM型阳性对照,产物经电泳,在紫外线下观看结果,并在凝胶上成像。 DNA序列分析3 PCR扩增的基因片段经电泳后,切下相应条带纯化,进行DNA测序,结果在GenBank序列数据库进行同源性分析（BLASTN）。 110 统计学处置2 细菌耐药性分析用 WHONET5软件进行分析，耐药率不同有显著性，用统计软件分析,

7、两组耐药率比较应用2检。表1 用于检测耐药基因的引物 2 结果与分析 21 ESBLs检出结果及耐药率 281株肺炎克雷伯菌和201株大肠埃希菌共检出ESBLs 194株，占40.%,非产ESBLs细菌为288株占%。产ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对抗生素的平均耐药率为%,明显较非产ESBLs株平均耐药率%高（P<。产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌除头孢替坦外，对其他头孢类抗生素的耐药率均在90%以上；对内酰胺和碳青霉烯类如氨苄西林、氨曲南和哌拉西林的耐药率为100%，仅对美洛培南和亚胺培南二种抗生素未产生耐药；产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对多种抗生素耐药率明显

8、高于非产ESBLs菌株（P&（表2）。表2 产ESBLs和非产ESBLs菌对抗生素的耐药率 22 产ESBLs菌株的PCR检测 对13株产ESBLs菌株（其中8株大肠埃希菌和5株肺炎克雷伯菌）的PCR产物测序，其中blaTEM阳性的扩增产物为TEM-1基因, blaCTX阳性的扩增产物为CTX-M-3基因,而blaSHV阳性的扩增产物那么别离为SHV-一、SHV-五、SHV-11和SHV-12。blaTEM、blaCTX和blaSHV基因的PCR琼脂凝胶电泳如图13。图1 TEM基因PCR扩增电泳图图2 SHV基因PCR扩增电泳图（1： DNA分子量标志,2000bp梯带； 2:阴性对照；35

9、:临床菌株。） 图3 CTX基因PCR扩增电泳图 blaTEM、blaCTX和blaSHV的基因检测结果 产ESBLs菌株的blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因检出率别离为%、%和32. 9%，产ESBLs菌同时具有1种的ESBLs基因如bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM 和 blaSHV+ CTX+ TEM基因检出率别离为%、%、%和%。其中93株产ESBLs大肠埃希菌中, blaTEM基因检出率为% （76/93）, blaCTX基因检出率为% （88/93）, blaSHV基因检出率% （13/93），blaSHV+ CTX基因检出率%

10、（12/93）， bla CTX+ TEM基因检出率% （8/93），blaSHV +TEM基因检出率% （9/93）, blaSHV+ blaCTX+ blaTEM基因检出率% （4/93）。101株产ESBLs肺炎克雷伯菌中, blaTEM基因检出率为% （37/101）, blaCTX基因检出率为% （57/101）, blaSHV基因检出率为50. 5% （51/101）, blaSHV+ CTX基因检出率% （13/101）， bla CTX+ TEM基因检出率% （11/101），blaSHV +TEM基因检出率% （8/101）, blaSHV+ blaCTX+ blaTEM基因

11、检出率 % （6/101）（表3）。 24 产ESBLs菌株阳性和阴性整合子对抗菌药物的耐药率 两组对头孢类抗生素如头孢他啶和头孢曲松的耐药率均>90%，经2查验P&不同无显著性，而产ESBLs菌株阳性对头孢噻肟和头孢唑啉的耐药率也均&90%，但与整合子阴性的产ESBLs菌株比较P&，不同有显著性。产ESBLs菌株阳性整合子对其他抗生素如氨苄西林和哌拉西林的耐药率均高于整合子阴性产ESBLs菌株,经2查验,不同有显著性（P&两组对亚胺培南和美洛培南的耐药率均很低（表4）。表3 3种基因型PCR产物在产ESBLs菌株中的散布表4 产ESBLs菌株阳性和阴性整合子对抗菌药物的耐药率 3 讨论

12、 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，常寄殖于人体上呼吸道和肠道，是重要的条件致病菌和院内感染常见的病原体之一4。ESBLs要紧在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中发觉。本文ESBLs从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检出率为%。产ESBLs菌对经常使用抗生素的平均耐药率高达%,对氨苄西林、环丙沙星、一二三代头孢菌素均具有很高的耐药率，产生了明显的多重耐药5。 由于ESBLs是质粒介导，可通过转化、转导、接合转移等方式传递而造成耐药菌流行。质粒、转座子和整合子对耐药基因在细菌间的水平转移起着重要作用5，6。本文用PCR检测产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中类整合子的散布,结果显示blaTEM阳性的圹

13、增产物为TEM-1基因, blaCTX阳性的扩增产物为CTX -3基因,而blaSHV阳性的扩增产物那么别离为SHV-一、SHV-五、SHV-11和SHV-12基因。blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因检出率别离为%、%和32. 9%，说明产ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因与整合子具明显相关性，但三者经质粒与整合子一起转移的频率不同。其中blaCTX的转移率最高,达到%,第二为blaTEM（ %），blaSHV的转移率最低。提示本文中产ESBLs临床分离株中的blaCTX与整合子紧密相关。推测blaCTX可能位于整合子中或与整合子位于同一个接合性质粒的遗

14、传元件上，可能是ESBLs菌株遗传元件的要紧流行方式。 本文71株产ESBLs菌同时具有1种的ESBLs基因,其中bla SHV+ CTX基因检出率为%、blaCTX+ TEM为%、 blaSHV +TEM为%和blaSHV+ CTX+ TEM为%。说明整合子携带着1个以上的多个耐药基因盒,与宿主菌的多重耐药性紧密相关。这可能揭露了本文中产ESBLs临床分离株对头孢类、-内酰胺类和喹诺酮类抗生素多重耐药的发生和转移机制7。也是致使整合子阳性株对三代和四代头孢菌素高耐药率的重要缘故。【参考文献】 1 戴自英，刘裕昆，汪复. 有效抗菌药物学，第2版.上海：上海科学技术出版社，1998，12-28.

15、2 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performanre standards for antimicrobial susceptibility testing. 9th informational zyne,PA :National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1999, 32-36.3 World Health Organization. WHO Global strategy for containment of antimicrobial resis

16、tance. WHO/CDS/CSR/DRS,2001,2.4 Hall MAL, Paauw A, Box ATA,et al. Presence of integron-associated resistance in the community is widespread and con-tributes to multidrug resistance in the hospital. J Clin Mi-crobiol, 2002, 40（8）:3038-3040.5 许景峰，刘杰 ，徐琳,等.临床病原菌的耐药性研究.药物不良反映杂志，2007，9（6）:388-392.6 Bonnet R. Growing group of extended-spectrum beta-lactama-ses: the CTX-M enzymes. Antimicrob Agents Chemother,2004, 48（1）:1-14.7 Arduino SM, Roy PH, Jacoby GA. blaCTX-M-2 Is located inan unusual class 1 integron （In35）which includes Agents Chemother, 2002, 46（7）:2303-2306.