果酒酵母发酵及菌种保藏Word格式.docx

1、用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺 旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般 微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻 干燥保藏法进行保藏。5）冷冻保藏法可分低温冰箱（ -20 至-30，-50 至-80）、干冰酒精快速冻结（约 - 70）和液氮（ -196）等保藏法。6）xx 保藏法2/ 15先使微生物在极低温度（ -70左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华 现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂 来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。

2、保护性溶质可 通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有 牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。3.实验材料和用具样品：xx水果及压榨汁。试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、 10%HC、l 干冰、 95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土 （有机物含量少的 黄土）或者红土；器皿：三角烧瓶 （250 mL）、无菌试管、无菌吸管 （1 mL及 5 mL）、无菌滴管、接种环、 40目及 100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷 灯、滤纸条（0.5 1.2cm）冰箱，低温冰箱（ -30），液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计

3、数板，显微镜，紫外线等（ 15W），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器4.操作步骤4.1 自选酵母发酵性性能的检测试验： 用选育菌种发酵果酒4.1.1果酒酿造的工艺流程3/ 15鲜果分选破碎、除梗 果浆分离取汁澄清清汁发酵倒桶贮 酒过滤冷处理调配过滤成品4.1.2工艺简述1）发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。 破碎、除梗：破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、 糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与 果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。破碎机有双辊压破机、鼓形 刮板式破碎机、离心式破碎机、锤片

4、式破碎机等。 二氧化硫处理：二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物 质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫 酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫 浓度为 60-100mg/L。此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活 性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生 物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加。2）果汁的调整 糖的调整：酿造酒精含量为 10%-12%的酒，果汁的糖度需 17-20 Bx。如果糖度达不到 要求则需加糖

5、，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。 酸的调整：4/ 15酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使红葡萄酒颜色鲜明；使酒味清 爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。 干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般 pH 大于3.6 或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。3）酒精发酵发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为 容器容积的，然后加入 3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在 20-28，发酵时 间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为 3-12 天。残糖降为0.4%以下时主发酵结束。然后应进行后发酵，即将酒容器密闭并移至酒 窑，在 1

6、2-28下放置 1 个月左右。发酵结束后要进行澄清，澄清的方法和果汁 相同。4）成品调配果酒的调配主要有勾兑和调整。勾兑即原酒的选择与适当比例的混合；调 整即根据产品质量标准对勾兑酒的某些成分进行调整。勾兑，一般先选一种质 量接近标准的原酒作基础原酒，据其缺点选一种或几种另外的酒作勾兑酒，加 入一定的比例后进行感官和化学分析，从而确定比例。调整，主要有酒精含 量、糖、酸等指标。酒精含量的调整最好用同品种酒精含量高的酒进行调配， 也可加蒸馏酒或酒精；甜酒若含糖不足，用同品种的浓缩汁效果最好，也可用 砂糖，视产品的质量而定；酸分不足可用柠檬酸。5）过滤、杀菌、装瓶5/ 15过滤有硅藻土过滤、薄板过

7、滤、微孔薄膜过滤等。果酒常用玻璃瓶包装。 装瓶时，空瓶用 2-4的碱液在 50以上温度浸泡后，清洗干净，沥干水后杀 菌。果酒可先经巴氏杀菌再进行热装瓶或冷装瓶，含酒精低的果酒，装瓶后还 应进行杀菌。4.1.3发酵性能测定测定一个发酵周期内酒精度及含糖量变化，绘制发酵曲线，并对自制果酒 进行感官评定，分析测定理化指标（糖度、酒度、酸度）。还原糖、总糖的测定：直接滴定法。总酸的测定：中和滴定法。酒度的测定：蒸馏法。5.菌种保藏（下列各法可根据实验室具体条件与需要选做）见实验十二。6.实验结果分析1）绘制发酵周期糖度及酒精度变化曲线。2）对酒样作感官品评，并作理化分析，测定葡萄酒的酒精、残糖、总酸。

8、7.问题和讨论1）菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？2）经常使用的细菌菌株，使用那种保藏方法比较好？3）简述果酒发酵主要影响因素。6/ 15附：总糖和还原糖的测定（一） x试x 剂比色法1.实验目的掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的 Cu2+被还原糖还原为 Cu2O （砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显 露出 Cu2O的红色即为终点。1）试剂xx 甲液：称取68.29g硫酸铜（ CuSO4?5H2O），溶于蒸馏水中并稀释到 1000ml。xx 乙液：称取 346g酒石酸钾钠及 100g NaOH

9、，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏 水稀释到 1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。0.25葡萄糖标准溶液：准确称取2.500g 经 98-105干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入 1000ml 容量瓶中，加入 5ml 浓 HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到 1000ml。2）器具7/ 15电热恒温水浴锅，调温电炉， 250ml 锥形瓶，滴定管1）标定预备试验：吸取费林溶液A、B各5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在 沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时， 加 2 滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记

10、录消耗的葡萄糖标准溶液的体 积。2）标定正式试验：戏取费林溶液5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和比预备试验少 1 mL的葡萄糖标 准溶液，加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。计算式中：F费林溶液A、B各 5 mL相当于葡萄糖的克数， g；m 称取葡萄糖的质量， g；V消耗葡萄糖标准溶液的总体积， mL。3）葡萄酒样品还原糖测定：8/ 15准确吸取一定量的样品（ V1）于 100 mL 容量瓶中，使之所含还原糖量为0.20.4g，加水定容至刻度。5.00 mL于 25

11、0 mL三角瓶中，加 50 mL水和一定量的试样（试样所含还原 糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持 2 min，加 2 滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下 于 1min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。 按式（4）计算。4）葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（ V1）于 100mL 容量瓶中，使之所含总糖量为0.4 g，加 5 mL盐酸溶液，加水至 20 mL，摇匀。于 681水浴上水解 15 min，取出，冷却。用 200 gL氢氧化钠溶液中和至中性，（加入 2 滴酚酞，用 NaOH溶液滴定至微红色）。调温至 20 ，加水定容至刻度（ V2）。吸取费林

12、 溶液5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和一定量的试样（试样所含总糖 量为9/ 150.4g），加热至沸，并保持 2min ，加 2 滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下 于 1 min 内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。 按下式计算。X总糖或还原糖的含量， gL；F费林溶液 、各 5 mL 相当于葡萄糖的克数， g；V1吸取的样品体积， mL；V2样品稀释后或水解定容的体积， mL；V3消耗试样的体积， mL；G葡萄糖标准溶液的准确浓度， gmL；V消耗葡萄糖标准溶液的体积， mL。所得结果应表示至一位小数。5.注意事项1）本法是根据一定量的碱性酒

13、石酸铜溶液（ Cu2量固定）消耗的样液量 来计算样液中还原糖含量，反应体系中 Cu2的含量是定量的基础，所以在样 品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入 Cu2，得到错误的结果。2）碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜 络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降 低。3）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与 Cu2的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时 会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。 保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消

14、耗10/ 15 量。 4）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以 防止空气进入反应溶液中。5）样品溶液应预测，其目的：一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求（0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗 的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以 调整，使预测时消耗样液量在 10ml 左右；二是通过预测可以知道样液大概消耗 量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少 1ml 左右的样液，只留下 1ml 左右样液在继续滴定时加入，以保证在 1 分钟之内完成继续滴定工作，提高测 定的准确度。6）必须严格控制反应液的体积，标

15、定和测定时消耗的体积应接近，使反应 体系碱度一致。热原一般采用 800W 电炉，电炉温度恒定后才能加热，热原强度应控制在 使反应液在两分钟内沸腾，且应保持一致；否则加热至沸腾所需时间就会不 同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴 定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液 少。滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控 制上述条件，力求一致。平行试验的样液消耗量相差不应超过0.1ml。滴定酸的测定 中和滴定法1）采用中和滴定法测定葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。2）适用于各种类型葡萄酒（果酒）中滴定酸含量的测定。以 g/

16、L 报告其结果，测定值保留一位小数。11/ 15利用酸碱中和的原理，以氢氧化钠标准溶液直接滴定葡萄酒（果酒）样品 中的滴定酸，用酚酞指示剂指示滴定终点，由所消耗的氢氧化钠标准溶液的体 积计算葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。3.试剂酚酞指示剂溶液， 10g/L：称取酚酞1.0g，溶于 60mL乙醇中，用水稀释至 100mL。0.1mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液。氢氧化钠标准溶液， c（NaOH）0.1mol/L 。1）配制将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清 亮，使用前虹吸上层清液。量取 5mL氢氧化钠饱和溶液，注入 1000mL不含二 氧化碳的水中，混匀。2）标定0.

17、6g于 105110烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001g。溶于 50mL不含二氧化碳的水中，加入 2滴酚酞指示剂溶液，以 新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。同时做空白试验。3）计算按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：Cm/（v1-v2） 12/ 150.2042C氢氧化钠标准溶液浓度， mol/L ； m基准邻苯二甲酸氢钾的质量， g； V滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积， mL； V1空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积， mL； 0.2042与1.00mL 氢氧化钠标准溶液 c（NaOH）= 1.000mol/L相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。1）样品的测定

18、取调温至 20的样品 2.005.00 mL（取样量可根据酒的颜色深浅而增减 ）置于 250 mL三角瓶中，加入中 性蒸馏水 50 mL，同时加入 2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准 溶液（ c（NaOH）0.1mol/L ）滴定至溶液微红色为终点，并保持 30s 内不变色，记录所消耗氢 氧化钠标准溶液的体积 V1。起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后， 再进行测定。2）空白的测定 吸取中性蒸馏水 50mL置于 250mL三角瓶中，同时加入 2 滴酚酞指示剂溶液，其余操作同 1。13/ 153）结果计算 按下式计算滴定酸的量，以 g/L 表示：X样品中滴定酸的含量， g/L;

19、c氢氧化钠标准溶液浓度， mol/L；V1样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，V0空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，V2吸取样品的体积， mL；Si与1.00mL 氢氧化钠标准溶液 c（NaOH）=1.000mol/L相当的，以克表示的试样主体酸的质量0.075；S苹果酸0.067；S柠檬酸0.064；S草酸0.045 酒度的测定1）采用酒精计法测定葡萄酒 （果酒 ）中酒精度。2）适用于各种类型葡萄酒 （果酒 ）中酒精度的测定， 数，即 %（v/v），保留一位小数。14mL；S酒石酸结果表示为体积百分/ 15以蒸馏法去除样品中的不挥发物质，利用酒精计和温度计直接读取酒精度和温度的示值

20、，并加以温度校正，求得 20 时乙醇的体积百分数，即酒精度3.实验材料全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。1）用一洁净、干燥的 100 mL容量瓶准确量取 100 mL（具体取样量应按酒 精计的要求增减）样品（液温 20）于 500 mL蒸馏瓶中，用 50 蒸馏水连续三 次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约 100 毫升时，用蒸馏水定容至 100mL2）将试样倒入洁净、干燥的 100mL 量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失 后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温 度计，平衡 5 min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温 度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成 20时酒精度。所得结果 表示至一位小数。15/ 15