呼吸系统药物动物模型Word格式文档下载.docx

1、 【注意事项】 同小鼠。 本法操作简单， 无需特殊的装置， 即知祛痰药的临床效果， 但由于同一动物不能前后比较， 故测定值的差值很大， 要得到正确的数据， 必须做很多动物是最大的缺点。 1.1.3 兔呼吸道分泌液量测定法 【操作步骤】 乌拉坦腹腔注射麻醉兔， 背位 20 度斜度， 头低位固定。 切开前颈部的皮肤暴露器官， 插入 Y 字形气管插管。 插管的一端连接调节器， 吸入温度、 湿度恒定的空气， 另一端连接有刻度的试管， 收集流出的呼吸道液体。 这个操作是简单的， 但是要得到正确的结果， 最重要的是吸入的空气要定温定时。 本法收集 24h 的液量（ml /kg） :兔 1.03.3 ml

2、/kg， 猫 1.55.1 ml /kg， 豚鼠 2.35.6 ml /kg， 大鼠 5.011.7 ml /kg， 呼吸次数与量没有关系， 秋冬季减少。 【注意事项】 实验开始后， 最初 1h 的液量多， 但 2h 后就相当稳定了。 第 2 个小时后作为对照， 大约收集 24h， 给药后再继续收集 2 h 或以上。 因为实验过程长， 麻醉药有一定的深度和持续时间， 所以乌拉坦最常用。 1.1.4 大鼠气管毛细管引流分泌液量测定法 【操作步骤】 取体重 160180gSD 大鼠， 腹腔注射乌拉坦 1.0g/kg 麻醉， 仰位固定， 解剖分离气管， 在甲状软骨下缘正中两软骨之间插入已知重量的玻璃

3、毛细管（毛细管长 10cm， 内径 0.8mm 左右） 使分泌液沿毛细管上升， 收集 60min 气管分泌引流， 称重后计算 60min/100g 体重的引流 mg 数。 正常分泌量2.961.6mg/100g 体重。 1.2 呼吸道纤毛运动实验法 从末梢细支气管到上部呼吸道粘膜上皮布满纤毛。 通过纤毛的运动可使呼吸道液体、 微粒、 痰和其它异物以大约 23cm/min 的速度向口腔方向运动， 这对呼吸道异物的排除起重要作用。 对于作用于呼吸道的药物， 特别是使用祛痰药时， 对纤毛运动究竟产生什么影响， 有必要加以研究， 祛痰药对纤毛运动的影响的经典方法是鸽纤毛运动实验法。 1.2.1 鸽纤毛

4、运动实验法 【器械和装置】 鸽子固定台、 木屑片（能通过 5 号筛， 而不能通过 6 号筛的染色木屑）。 【操作步骤】 将无麻醉鸽背位固定沿颈部中线先后将皮肤和气管切开， 暴露气管粘膜可观察到气管内面的粘膜， 把木屑片放在气管下段， 随着粘液的移动， 测定移动 2cm 所需的时间。 正常鸽平均所需 45min。 1.2.2 兔离体气管纤毛实验法 【操作步骤】 兔体重 1.52kg 左右， 雌雄兼用， 木槌击昏后迅速分离气管， 置通 O2的台式液中， 保存备用。 实验时， 剪取气管 10.5cm 长。 正中剪开， 纵向分成两片， 取单片斜放于 37台式液湿润的棉花上（喉头端朝上）。 将发丝（0.

5、170.23mm） 置于下端用低倍镜观察， 并记录发丝运行 2mm 所需时间， 计算出运行速度， 每观察 1 次， 将气管片放入 37台式液中漂洗 1 次。 每个标本观察三次， 取均值， 然后放入含药液的营养液中 5min， 同法观察三次， 取均值。 发丝运动速度为 0.800.810.260.34mm/min。 1.3 豚鼠气道粘液多糖的测定咔唑比色法 【试剂】25 m mol/L 四硼酸钠浓硫酸溶液： 称取 9.48g Na2B4O710H2O 溶于 1L 浓硫酸 （相对密度 1.84）中； 7.5mmol/L 咔唑溶液： 称取 62.5mg 咔唑溶于 50ml 无水乙醇中。 D-葡萄糖醛

6、酸内酯贮存标准液： 称取 D-葡萄糖醛酸内酯 9.07mg,溶于 3mol/L 氯化钠 100ml 中。 【操作步骤】 健康豚鼠， 麻醉处死， 取出气管称重， 剪开气管用棉棒取气道粘液， 取出的粘液用 3ml蒸馏水洗下， 3000r/15min 离心， 上清液待用。 取 25m mol/L 四硼酸硫酸溶液 2.5ml 加上清液 2.5ml， 冷却后混匀， 沸水浴中加热 10min， 返回室温， 加7.5m mol/L 咔唑溶液 0.1ml， 混匀后再 100水浴中 15min 加热， 返回室温， 分光光度计 530nm 比色。 D-葡萄糖醛酸内酯标准曲线： D-葡萄糖醛酸内酯储存标准液用 3m

7、ol/L 氯化钠稀释成 25200g/ml， 制作标准曲线。 1.4 大鼠气道粘液中肺表面活性物质的测定 对祛痰药进行肺泡 2 型细胞分泌肺表面活性物质的研究， 有利于阐明祛痰药的作用机制。 肺表面活性物质在成熟肺由肺泡 2 型细胞生成， 其主要成分为饱和型卵磷脂， 它的作用是降低肺泡表面张力， 祛痰药可通过促进肺表面活性物质分泌， 降低肺泡表面张力， 有利促进肺泡-支气管的廓清作用， 测定饱和型卵磷脂可了解肺泡 2 型细胞功能及祛痰药对其的影响。 【实验操作】 （1） 支气管肺泡灌洗液的取得： 大鼠灌胃给予祛痰药， 半小时后麻醉， 分离气管， 行气管插管后用生理盐水 5ml 冲洗肺， 约得

8、3ml 支气管肺泡灌洗液。 （2） 磷脂的提取： 支气管肺泡灌洗液经离心后， 取上清液 1ml， 加氯仿 2ml， 摇匀后 2500r/10min 离心，下层溶液吸入到具塞试管内 5060水浴氮气吸干。 （3） 饱和卵磷脂的分离： 再具塞试管内加锇酸溶液 0.5ml， 振摇后放置通风橱内静置 15min， 再在 4050水浴中， 通氮气吸干。 （4） 薄层色谱扫描定量 活化： 将硅胶板 G 置 110烤箱 1h。 点样： 将分离后的样品加定量的氯仿溶解， 点样于薄层板上， 置 110烤箱 1520min。 展开： 将板放入展开剂中， 待展开剂前缘离点样处 1cm 后取出。 显色： 展开后将板放

9、置110烤箱 510min 取出， 用溴百里香酚蓝染色后清水冲板至本底无色， 滤液吸干， 110烤箱 510min，显示清晰的蓝色斑点。 然后用日本岛津 Cs-930 型薄层扫描仪， 630nm 波长对标准斑点及样品斑点进行扫描定量。 2 镇咳药物实验法 2.1 咳嗽反射:咳嗽反射弧由 4 个环节组成。 （1） 感受器： 目前了解至少有三种： 呼吸道上皮下的感受器， 能感受化学刺激或机械刺激； 伸展感受器位于呼吸道的平滑肌束中， 能为肺呼吸气所激动； 软骨周围的感受器。 （2） 传入神经： 包括迷走神经及其分支， 大部分冲动起源于肺的伸展感受器和呼吸道上皮下的感受器； 喉部的感受神经末梢， 由

10、喉上神经所支配； 舌喉神经； 某些交感神经支。 传入神经纤维主要在迷走神经中。 迷走神经切断后， 咳嗽反射可部分消失。 2.2 诱发咳嗽的方法 从咳嗽反射弧来看， 目前采用的诱发咳嗽的方法主要是刺激感受器和传入神经， 常用的方法有： （1） 机械刺激法； （2） 化学刺激法； （3） 电刺激法 （1） 机械刺激法： 对麻醉动物， 可用一细塑料管或小毛刷插入喉部或直至气管内， 来回 23 次， 可引起动物短促的剧咳。 亦有直接由气管套管内， 插入细塑料管或细铜丝刺激气管叉隆凸， 亦可引起动物剧咳。 后一种刺激方法结果可靠。 这些刺激方法简便可行， 不需要特殊的仪器， 但刺激强度不能控制， 无法进

11、行定量比较。 （2） 化学刺激法： 二氧化硫、 氨、 丙烯醛、 硫酸、 枸橼酸等刺激性物质气雾吸入呼吸道内， 刺激呼吸道上皮下的感受器， 可引起咳嗽。 给予刺激性物质的方式一般有两种： 气雾吸入： 将不麻醉动物（多采用豚鼠、 小鼠， 亦有采用大鼠） 置于恒定容积的密闭容器内， 注入定量的刺激性气体， 动物吸入后即可引起咳嗽。 刺激性酸类则借恒压的气雾发生器喷入密闭容器内， 气雾颗粒直径要求为 27m， 使能充分弥散呼吸系统内， 引起咳嗽。 直接注入： 麻醉动物（多采用豚鼠、 猫、 狗、 亦有采用兔） 插入气管套管， 将定量的刺激性气体直接注入气管套管内， 即能引起咳嗽。 亦有将肥皂粉、 淀粉或

12、滑石粉直接吹入气管内， 亦能引起咳嗽。 化学刺激法还包括利用化学物质刺激咳嗽反射弧的任何环节而引起咳嗽的其他方式， 今年来发现在猫经脉注射二甲基苯基哌嗪， 这是一种神经节兴奋剂， 它能引起咳嗽， 且其注射剂量与发生咳嗽次数在一定范围内呈线性关系。 该方法已作为镇咳药的筛选方法。 3 电刺激法:以电刺激法诱发咳嗽， 常用的刺激部位有两种： 喉上神经： 多采用猫或豚鼠； 气管粘膜： 多采用豚鼠或狗。 此外， 亦有直接刺激猫的延髓背侧部或狗的胸膜而诱发咳嗽的。 点刺激法可用一定的刺激频率和刺激强度引起可靠的咳嗽， 用药前后可进行定量的比较， 该法较机械刺激法可靠。 2.3 动物的选择 豚鼠对化学刺激

13、物或机械刺激都很敏感， 刺激后能诱发咳嗽； 刺激其喉上神经亦能引起咳嗽， 加之一般实验室较易得到， 因此， 豚鼠使筛选镇咳药常用的动物。 猫在生理条件下很少咳嗽， 但受机械刺激或化学刺激后易诱发咳嗽， 而猫较豚鼠难得， 故猫选用于刺激喉上神经诱发咳嗽， 在初筛的基础上， 进一步肯定药物的镇咳作用。 狗不论在清醒或麻醉条件下， 化学刺激、 机械刺激、 电刺激胸膜、 气管粘膜或颈部迷走神经均能诱发咳嗽； 狗对反复应用化学刺激所引起的咳嗽反应较其他动物变异少， 故特别适用于观察药物的镇咳作用持续时间。 但狗从经济上和来源上较豚鼠和猫昂贵和难得， 只能用于进一步肯定药物的镇咳作用。 兔对化学刺激或电刺

14、激不敏感， 刺激后诱发喷嚏的机会较咳嗽为多， 故兔很少用于筛选镇咳药。 小鼠和大鼠以化学刺激虽能诱发咳嗽， 但喷嚏和咳嗽动作很难区别， 变异较大， 特别是反复刺激时变异更大， 实验可靠性较差。 根据国内有关单位的经验， 认为小鼠作为初筛镇咳药的动物， 还是可取的。 几种常见的引咳动物实验： 2.3.1 小鼠氨水引咳法 【操作步骤】 将小鼠置于 500ml 玻璃钟罩内， 通过空气压缩机（或脚踏风箱） 连接玻璃喷雾头， 以400mmHg 恒压将氨水（25%28%氢氧化铵） 均匀的喷入钟罩内， 喷雾 5 s， 然后观察和记录小鼠的咳嗽潜伏期和 2min 内咳嗽次数。 【注意事项】 咳嗽潜伏期是指喷雾

15、氨水开始时间至发生咳嗽所需的秒数。 小鼠咳嗽表现以其腹肌收缩（缩胸）， 同时张大嘴为准， 有时可有咳声， 观察必须仔细。 亦有以引起一半小鼠咳嗽的喷雾时间（FDT50） 为指标。 2.3.2 小鼠二氧化硫引咳法 【操作步骤】 取 25ml 蒸发皿 1 只， 内盛 0.5g 无水硫酸钠， 将盛有 50%硫酸的滴定管， 置于蒸发皿上，迅即滴入硫酸 5ml， 并立即将 500ml 的玻璃烧杯或钟罩扣在蒸发皿上， 烧杯内充满恒定浓度的二氧化硫气体。 迅速将小鼠放入含有 SO2的玻璃烧杯内， 然后观察和记录小鼠的咳嗽潜伏期和 2min 内咳嗽次数。 【注意事项】 本实验无水硫酸钠的称量必须准确， 发生

16、SO2、 扣玻璃烧杯和放入小鼠的动作力求迅速，否则明显影响实验结果。 亦可用 0.5g 硫代硫酸钠加入 1mol/L 盐酸 5ml 产生 SO2。 烧杯内 SO2浓度要求在 1:50000， 该浓度足以引起咳嗽。 浓度过高（1:10000） 易致中毒。 2.3.3 豚鼠枸橼酸引咳法 【操作步骤】 取体重 200250g 的豚鼠， 置于 24L 容积的密闭钟罩内， 以 60mmHg 的压力通过玻璃喷头喷入 17.5%枸橼酸 （要求通过玻璃喷头的气流速度为 15L/min）,喷雾 1min， 记 录 5min 内豚鼠的咳嗽次数。 【注意事项】 豚鼠的咳嗽声响亮， 应以听到的计算。 实验豚鼠应预先挑

17、选， 5min 内咳嗽少于 10 次者弃除。 2.3.4 豚鼠丙烯醛引咳法 【丙烯醛制备】 以等量的甘油与硫酸氢钾混合于烧瓶中， 在 200油浴上加热， 慢慢地把产生的丙烯醛收集于球胆中， 供实验用。 【操作步骤】 取体重 200250g 的豚鼠， 雌雄不拘， 放入 48L 的密闭容器内， 通常可放入两只豚鼠，1 只为对照， 1 只为用药的。 然后用注射器从球胆中抽取丙烯醛 8ml， 讯即注入密闭容器内， 计算 5min 内豚鼠的咳嗽次数， 分别加以记录。 【注意事项】 豚鼠亦应预先进行挑选， 5min 内咳嗽次数少于 10 次者弃除。 2.3.5 豚鼠电刺激引咳法 【操作步骤】 豚鼠， 体重

18、 300400g,雌雄不拘， 乌拉坦麻醉（25%溶液， 1g/kg,腹腔注射）。 待麻醉后，切开颈部皮肤， 分离气管， 插入 Y 形气管套管， 一个支管与气鼓相连接， 可将呼吸运动记录在记纹鼓上，一个支管连接一橡皮管， 借助于再字夹的调节， 使记纹鼓上描记的呼吸运动维持在适当的水平。 亦可与压力换能器相连接， 通过自动记录仪记录呼吸运动， 灵敏度较气鼓好。 用一白金制的单级电极固定于气管的背面， 放置单极电极的部位尽可能接近胸部， 另一无关电极使由缝针制成， 插入胸部皮下组织。 一般采用刺激强度 3.5V， 脉冲宽度 50ms， 频率 10 次/s， 刺激时间 20s， 两次刺激的时间间隔为

19、5min。 电刺激时，由于咳嗽可使记纹鼓上的呼吸振幅明显增高。 受试药物可经静脉、 腹腔或灌胃给予， 用药后 5、 10、 15、30、 45min 重复给予电刺激， 比较记纹鼓上呼吸振幅的变化。 受试药物能抑制呼吸振幅， 即认为具有镇咳作用。 作用强度以抑制百分率表示。 【注意事项】 以本法引咳约有 5%的豚鼠可对刺激无反应或不能发生复制反应， 这些动物应弃除。 本法测得磷酸可待因 ED50为 35mg/kg， 非那根 ED50为 14mg/kg。 2.3.6 猫电刺激引咳法 【操作步骤】 猫电刺激引咳法最常用的是电刺激喉上神经引咳法。 以氯醛糖麻醉猫（氯醛糖以丙烯甘油溶解， 按 80mg/

20、kg 腹腔注射）， 如无氯醛糖， 亦可用戊巴比妥钠麻醉（30mg/kg,腹腔注射）。 麻醉后， 将猫背位固定于手术台上， 沿颈中线切开皮肤， 分离皮下组织。 喉上神经系由结神经节分出后由腹面穿过颈总动脉， 在甲舌骨肌的尾端水平分布至喉部粘膜。 因此， 操作时可先找出迷走神经， 再沿迷走神经向头端找出结神经节， 即可见喉上神经由神经节分出。 然后细致的分离出喉上神经， 注意不要损伤神经， 按上保护电极， 为了避免神经干燥， 并保证神经与电极接触良好， 可用低熔点液体石蜡涂在神经与电极的接触部位， 最好能让石蜡凝固。 固定电极， 以备刺激。 其次， 切开腹部皮肤， 暴露一部分腹直肌， 并缝一丝线于

21、肌肉上， 牵引于描记杠杆上， 描记膈肌收缩活动于记纹鼓上。 亦可牵引于拉力换能器， 通过自动记录仪加以记录。 猫咳嗽时， 由于膈肌活动， 牵引腹直肌， 借以记录其咳嗽的次数及强度。 分离股静脉， 供给药用。 手术完备后， 开始刺激喉上神经， 找出每只猫的电刺激引咳阈值（以刺激电压表示）。 一般采用刺激频率 4050 次/ 次， 脉冲宽度 0.5ms， 连续刺激 5s， 两次刺激时间间隔为 25min， 刺激电压由小至大逐步递增， 测出每侧喉上神经在连续刺激 5s 出现咳嗽的电压数， 即为该猫的咳嗽阈值。 各猫的阈值分布在 29V之间， 多数猫在 79V。 两侧喉上神经阈值接近。 股静脉注射磷酸

22、可待因 13mg/kg,可以明显抑制， 甚至完全抑制咳嗽反射。 2.3.7 猫二甲基苯基哌嗪（DMPP） 引咳法 【操作步骤】 以氯醛糖麻醉猫（80mg/kg,腹腔注射）， 待麻醉后， 由股静脉注入碘化二甲基苯基哌嗪，该化合物的剂量与引咳的次数呈直线关系。 DMPP 的剂量与引咳的关系 DMPP 的剂量（g/kg） 猫 数 咳嗽次数 5 15 1.130.40 10 15 2.070.39 15 15 3.330.61 20 15 4.000.39 25 15 5.000.48 50 15 6.200.60 100 9 7.781.61 2.3.8 猫碘溶液引咳法 【操作步骤】 体重 2.5k

23、g 以上的猫， 用乙醚麻醉， 背位固定于手术台上， 减去其胸廓右侧沿腋中线倒数第 56 肋间的毛， 用碘酊消毒该处皮肤， 再以消毒注射器由这倒数第 56 肋间注入 1%碘溶液 （含碘 1%，含 K12%） 1ml 于胸膜腔内， 针头插入深度约 2cm。 注射后 2472h， 即有一部分猫发生咳嗽。 咳嗽次数的测定， 即用拇指和食指挟猫颈的甲状软骨（或环状软骨） 两侧共 4 次， 计算每次咳嗽次数，记录其咳嗽的平均次数。 用药后观察 1/2、 1、 1.5、 2、 3h 的咳嗽次数。 胸膜内注入 2%碘溶液 2ml， 产生咳嗽的猫数虽较注入 1%碘溶液 1ml 者略多， 但猫死亡较快， 故一般采

24、用 1%碘溶液 1ml 为宜。 如选的强壮的猫， 亦可在同一动物观察数种药物， 能减少生物的参差性。 2.3.9 辣椒素引咳实验法 【基本原理】辣椒素主要通过刺激 C 纤维释放递质引起咳嗽和支气管收缩反应， 引起的豚鼠咳嗽反应。 【操作步骤】 将 350500g 豚鼠置于特制的密闭箱盒内， 用超声波雾化器以 0.5ml/min 容量雾化吸入0.03mol/L 辣椒素 2min 引咳， 计数 10min 内咳嗽次数（约 1020 次 ） 。 【注意事项】 辣椒素可引起豚鼠气道收缩反应， 造成豚鼠窒息死亡。 2.4 麻醉问题 一般认为麻醉过深能明显抑制咳嗽反射， 影响实验结果， 例如以点刺激猫喉上

25、神经引咳， 采用巴比妥类麻醉， 往往可因麻醉过深， 使电刺激失去反应； 或者刺激阀可受麻醉深浅度的影响， 变异较大， 且不宜连续观察药物的作用。 又如以二甲基苯基哌嗪经脉注射引咳， 采用巴比妥类或乌拉坦麻醉时， 即不能引起咳嗽。 因此， 进行镇咳药筛选时， 尽可能采用清醒动物进行， 以保证咳嗽反射的存在。 即使采用麻醉，亦应维持浅麻醉。 麻醉剂选用氯醛糖较好， 对咳嗽反射几无影响。 3 呼吸兴奋药实验法 呼吸兴奋药实验法由一系列实验组成， 主要包括： 肺机械功能指标的测定机呼吸兴奋作用部位及机制研究的实验方法。 前者主要包括呼吸频率、 潮气量或每分通气量、 血气分析及肺泡气 CO2含量测定方法

26、等；后者包括中枢直接注射法、 电活动导出实验、 和排除或确立反射性呼吸兴奋作用等一些实验。 3.1 呼吸兴奋指标的测定法 【基本原理】 置于密闭容器内的动物呼吸时产生容器内的气压变化， 以压力换能器转换成电信号可以描记到呼吸时容积的变化和呼吸频率。 【操作步骤】 动物可选用兔和猫， 以乌拉坦（约 1 g/kg, iv 或 ip） 麻醉后， 分离颈静脉插入导管以备给药用,然后将动物置于一特制的身体体积描记器 内密闭， 动物呼吸借皮管连接气管插导管通向描记器，令其自然呼吸， 动物的吸气、 呼气引起胸廓起伏以压力换能器连接到记录仪描记呼吸时的容积变化， 此乃麻醉动物正常呼吸运动的潮气量和呼吸频率或每

27、分通气量测定方法。 亦可以预先给予吗啡（510mg/kg）、苯巴比妥（20mg/kg） 等呼吸抑制剂造成呼吸抑制动物模型（应用吗啡剂量应小于 16 mg/kg， iv 为好） 观察呼吸运动的变化， 再给予受试物观察上述指标的改变。 同时也可以进行血气分析或其它的肺功能指标测定， 以评价受试物的药效。 【注意事项及评价】 测定并绘制受试物的量效反应曲线， 并计算药物产生呼吸兴奋的剂量（RD50）、 致惊厥剂量（CD50）、 致死剂量（LD50）、 和治疗指数； 或测定阳性药物（尼可刹米 50mg/kg） 和受试物呼吸兴奋作用的最小剂量 （RD）和产生惊厥的剂量 （CD）， 并计算相应的 CD/RD 值。 受试物的治疗指数或 CD/RD比值与阳性药比较， 可以得到受试物的特性。 本试验尽量避免干扰因素且受试物最好选用静脉内给药。 3.2 呼吸兴奋作用部位及机制实验方法 3.2.1 呼吸中枢直接注射法 【基本原理】 呼吸运动主要受呼吸中枢调节， 发出的神经纤维支配呼吸肌的运动神经元， 通过肋间神经和膈神经支配呼吸肌群调节呼吸频率和深度。 呼吸兴奋和抑制药如直接作用于呼吸中枢局部， 引起呼吸运动的变化， 说明该药物具有直接兴奋或抑制呼吸中枢的