临床基因扩增PCR诊断实验室工作规范试行Word下载.docx

1、（5）专用工作服和工作鞋;（6）专用办公用品;（7）消耗品: 一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离。心管和加样器吸头（带滤心）;（8）可移动紫外灯（近工作台面）。1（2（标本制备区 标本贮存、核酸提取及贮存均在本区内进行。RNA测定时的单键。cDNA合成也在本区进行。本区仪器设备自己置:（ l）4冰箱、,20 或-70 冰柜三（ 2）高达台式冷冻离心机;（3）混匀器;（4）水浴箱或加热模块;（5）微量如排器若干支（覆盖l,1000l）;（6）专用工作服和工作鞋;（7）专用办公用品;（8）消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）;（9）可移动紫外灯（近工作台

2、面）;（10）超净工作台;（11）超声波水浴（处理大分子DNA适用）。1（3（扩增反应混合物配制和扩增区 模板材料（来自标本制备区）和主反应混合液（来自试剂贮存和准备区）的加入以及扩增反应等专门在本二（作区内近行。（l）核酸扩增仅三（2）微量加样器（覆盖1,1000 l）;（3）专用工作服和工作鞋;（4）专用办公用品;（5）消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）;（6）可移动紫外灯（近工作台面）。1（4. 扩增产物分析区 本区面积应为6,8m 。扩增严物的分析在本区进行。视检测方法不同而定，如为PCR�ELISA，则需（l）微量加样器若干支（覆盖l,2s

3、（2）酶标权、洗报机和恒温箱;（4）专用办么，用品;,次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）;2（临床基因扩增诊断实验室质量保证 临床基因扩增诊断实验室质量保证涉及到整个基因扩增检测的所有阶段，即测定分析前的标本来集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。2（1（标本的采集 常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或拘檬酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆（痰、脑普液、尿及分泌物等。采样容器最好是密闭的一次性的，如真空系血管。一次性塑料容器使用时无需进一步预处理。当使用非密闹采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采禅，必须注意防止来自来样者的皮屑或分泌物的污染。采样者采样时起码

4、要谈（一次性手套。可重复使用的玻璃器应高压处理，因为玻璃器（常含有不易失活的ANA酶。RNA酶的主要来源是实验人员的手。最好是热灭菌， 250 烘烤 4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。通常EDTA和拘檬酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除肝素。临床用于RNA（如HCV RNA）测定的血标本最好进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则物血后，必须在1小时内分离血清。2（2（标本的稳定化处 DNA分析，标本采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送到实验

5、室。由于RNA易于降解，因此用于RNA测定的标本的稳定化处理有时是必不可少的， Chaotropic物质特别是异硫氨酸抓盐（Guanidine thiocyanate，GITC）可使DNAse和RNAse立即失活。 在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆加入含有GITC的试剂管中进行稳定化处理。GITC可使RNAse不可逆失活的适合浓度为5mol/L。如果GITC浓度小于 4mol,L;RNA会很快降解。在适当的稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。如果温度低于室温，GITC即会结晶，所以在加入标本前应使之完全溶解。如标本不能及时送到实验室，最好选用 GITC处理方法以稳定标本。2（3标本

6、的运送 标本来集后应尽快送至实验室，经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于 DNA提取的含 EDTA的全血标本及用于 RNA提取的经 GITC 稳定化处理的标本。是否冷藏取决于标本的用途，较长时间在室温贮存会导致灵敏度大大降低。通常应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果在未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。2（4（标本的贮存 临床体液标本如血清,血浆等可于-70 下长时间贮存。用于DNA测定的核酸样本应在 10mmol,L Tris， lmmol,L EDTA缓冲液（pH 7（5,8（0）中 4 保存。用于RNA测定的核酸样本应在缓冲液中一80 C或

7、液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在一20OC即可。用 GIT（:稳定化处理的 RNA标本在室温可保存 7天，如贮存时间较长，则RNA测定敏感性略有下降。2（5（标本的处理（核酸提取） 核酸提取是决定扩增检测成败的关键性步骤。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致。抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中确（留的有机溶剂（如酚、氯份等），这些物质对其后的酶反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。如在 HBVDNA PCR测定中。采用对血清杯水煮沸裂解以释放DNA的方法时，肉眼观察不明显的溶血也会对扩增测定有很强的抑制作用，应使用正规的核酸

8、提取方法（如经典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等）。当标本为疾时，则必须先进行液化处理。再提取核酸。需注意的是;液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为 RNA时，降解是一个主要问题。 RT,PCR测定失败的常见原因是标本在运送前来经充分的稳定化处理（及核酸提取试剂的RNase的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果没（现RNA降解的证据。实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议常规使用高质量的商品核酸提取试剂。2（6靶核酸的逆转录和扩增 2（6.l靶RNA的逆转录 cDNA合成为RT-PCR中的第一个酶反应步骤，所产生的 cDNA为靶R

9、NA的反向互补链。为后面扩增的模板。下述因素通常影响cDNA合成的效率:l）RT活性的降低或完全缺乏。必须排除由于酶质量不高、试剂降解或加样错误而引起的 cDNA合成不充分。2）RT或热稳定聚合酶的抑制物（如酚、血红素）。当RNA明显为完整而没有扩增时，应怀疑有此类抑制物。3） RNA的降解。2（6（2影响扩增的因素 有多种因素可引起PCR的假阳性或假阴性结果，如抑制剂或酶活性丧失（见上）、迟大温度不对、晚十十浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。反应孔中热传导的均一性极为重要，循环仪的温度控制和加热块中热传导的一致性必须有常规的检查以避免假阴性结果。2（7污染 在实际工作中，常见有以下几种污染类

10、型:PCR片段的污染（产物污染）三天然基因组DNA的污染;试剂污染（贮存液或工作液）:以及交及污染（如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本）。对于所有的扩增技术，由于围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐，所以防止污染重在预防。一旦发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源为止。如果没有例外，实验结果必须作废，即使平行的污染质控中仅有一管显示出有PCR片段污染。2（7（l（测定分析前的污染源。测定分析前实验材料的污染主要来自非病人标本来源的核酸。2（7（2（测定分析阶段的污染源。通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的

11、实验设备的任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂（例如今血清白蛋白，明腋成矿物油）;商品酶制剂;消耗品（如反应管，吸头）和实验设备（如加样器、离心机）。污染的来源之一是许多样本在同时制备时的交及污染，但最主要的污染来源为以前扩增产生的特异产物DNA片段。在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使用的试剂、消耗品或实验设备的污染。而在产物分析区，当吸取PCR产物用于检测时，非常容易引起污染，因此必须制定并严格执行标准操作程序。2（7（3（污染的避免。要避免污染，首先应是预防而不是排除污染，前面所述工作区的严格划分的目的正是为了预防污染。为避免以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉

12、。如在扩增反应中用dUTP取代部分dTTP:从而产生的特异扩增片段含有尿嘧啶，这样扩增前在反应混合液中加入尿嘧啶糖激酶（UNG），可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避免其对将要进行的扩增测定的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射，通过异补骨脂素光化;单产生DNA加合物，由于DNA加合物对扩增没有反应但又不妨碍PCR后杂交过程，所以这些方法也能防止污染。由于上面提到的方法会给人一种假的安全感，所以不能以其来替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩增的天然 DNA的污染。2（7（4（去除污染的措施。工作完后必须定期采取有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最佳效果。去污染

13、措施包括但不仅限下面几种:用100ml,L次氨酸钠清洁表面;试验了后长时间的紫外照射实验操作台和其他表面;实验设备如加样器的高压消毒。2（8（扩增产物的分析 扩增产物的测定有各种方法。如电泳、限制性酶切、斑点印迹、杂交、测序、分光光度法定量等。但临床PCR测定项目基本上都使用探针杂交方法。2（8（l（与杂交检测有关的干扰。杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适。最常使用的基因探针有:DNA片段、合成的尊核普酸和体外的转录本（反义 RNA探针）。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光景和同位素等。在扩增后的杂交检测中，应该严格遵守商品试剂

14、盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性。还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高润度和,或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密控制温度和试剂是避免假阳性和假阴性结果的先决条件，要注意的是，温度和离子强度不能同时改变。2（9（质量控制 如上所述，应该开展各种质控来评价测定分析当中各步骤的质量，如RNA的完整性、对扩增是否合适和敏感。2（9（1（室内质量控制 必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和假阴性，保证测定结果的准确性。由于PCR测定的高敏感性，所以试剂的生产、实验材料的准备、PCR本身和实验中的每一步都要求有质控。扩增反应前后

15、的酶反应各步也应有质控，只不过在质控细节上稍有不同。2（9（1（1（与实验材料的准备有关的质控。对DNA提取试剂的效果最常用球脂糖凝胶电冰来检测。可知所提取的DNA是否发生降解。用常规的手工提取方法制备的DNA的平均长度一般为,100kb，用适合PCR的DNA提取试剂盒制备的DNA的长度平均范围为30&40kb。然而;明显出现降解的DNA（在1和10kb的低分子量范围内）在经琼脂糖凝胶电冰分离和用溴化乙锭染色后也可见有强的荧光信号。用对甲基化不敏感的限制性内切酶（如EcoRI）消化DNA，然后电泳分离，能够对酶活性的抑制剂进行质控（在抑制剂存在的情况下，高分子量的片段不被酶切）。潜在的抑制剂的

16、存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估计，好的 DNA提取物，A260/A280 比值应该在 1（ 75-2（0之间;否则，污染（残留的蛋白或酚）可能会很高。仅用光度计比色方法不能对DNA的完整性下结论。最快的对总RNA提取质量控制的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电冰，这一点跟DNA分离相同，然而，如果对结果产生怀疑，就应该在变性的条件下作琼脂糖凝胶电泳以检测RNA的完整性。在理想情况下，三种主要的核糖体RNA（28S、18s和 5S）在凝胶上出现的带相对较窄。如发生RNA的降解。则带被拖向低分子量或出现带的缺失。测定核糖体RNA带的密度指数可作为对RNA制备的质量评价的实验室内

17、的标准;对向低分子量拖尾的、不对称性的峰的评估也是RNA完整性的合适的指标。另外，琼脂糖凝胶电泳能显示出在RNA的制备中被DNA污染的程度。由于这些原因，单独的光电比色不能对RNA的完整性下结论。2（9（1（2（对cDNA合成和扩增的质控。本部分包括阳性质控和阴性质控。2（9（l（2（l（cDNA的合成。对CDNA合成的效率进行监控的关键性的质控是使用一个内反应质控。cDNA的合成可以从存在子每一个RNA提取物中的cRNA 转录本开始（即普遍表达的mRNA，如核糖体蛋白转录本这一类的所谓的管家基因），也可从在制备时加入样本中的作为内标准的 RNA开始。cDNA合成的内质控是能够产生确定产物的阳

18、性质控;如果扩增不成功，质控就显示出有RNA的降解、cDNA合成的过程中错误启动或酶活性丧失。加入确定量的扩增质控物可以检测RT&PCR的灵敏度。对于RT,PCR方法 所必须的污染质控为无逆转录靶RNA的阴性质控。2（9（1（2（2（PCR反应。内反应质控是阳性质控。可使用对有机体存活所必须的靶基因作质按，这些基因至少以丰台子状态存在，因为如果基因组缺失这些基因，将使有机体致死（所谓的致死因子），一个比较好的例子就是维生素D血浆结合蛋白的基因;在世界范围内的许多种族已发现其广泛的多态性，并且还没有发现基因活性的同源性丢失，因此，通过PCR共同扩增这种基因的一个片段，在所有患者中均可获得成功，并

19、且也会证明扩增反应是成功的。在测定血清,血浆病原体核酸如HBV DNA、HCV RNA等时，应使用已知的弱阳性血清,血浆作为质控样本，与持测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断扩增检测的有效性。使用这些外加弱阳性质控不但可检测扩增反应液的质量，还可获得有关PCR检测下限和特异性的信息。这些质控必须使用与诊断实验（即患者的标本）所使用的相同的主反应混合液。如果怀疑方法的检测下限不足以检测出产物时，则每一个反应管都必须加扩增质控。外加阴性质控（污染质控）在每一个PCR实验中都必须设有，应该包括几种阴性质控。通常，这些质控是民来指明PCR过程中污染出现的阶段。包括在样品制备的整个过程中所带的空白反

20、应管、含有样品制备时所用的所有反应液但不含可扩增的模板（所谓的模拟制备）的反应管等。模拟质援可以评估PCR实验的综合质量。此外，为对吸样过程进行质控，可以水质控样本来代替核酸样本加入至反应管，反应管中含所有的反应成分。实际工作中仅通过水样本来检测污染是否存在的方法是不可取的，因为它不能发现样本处理过程中的污染源，水仅可作为扩增试剂的质控。在扩增靶RNA的PCR实验中，应做省略逆转录的污染质控，通过这种方法，可发现以前扩增的DNA片段所引起的污染。2（9（l（3（对测定结果评价的质控（ 2（9（1（3（1（板上来交和膜上斑点印迹杂交的质控。在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中使用了不同杂交条件而造成的对结果的错误解释。2（ 9（ 2（室间质量评价能力验证，proficiency testing） 所有开展临床基因扩增检测的实验室都应参加由卫生部临床控验中心组织的全国临床基因扩增项目的空间质量评价，并作为开展临床基因扩增诊断的依据之一。本工作规范自公布之日起实施。卫生部医政司