孔雀石绿脱色研究.docx

1、孔雀石绿脱色研究孔雀石绿脱色研究1 引言合成染料广泛应用于印染、制皮、化妆品、印刷、医药和食品加工等行业，然而，这些染料大多数都具有生物毒性和致畸致癌性，而且在自然环境中极难生物降解，对光、生物酶和其他环境条件的抵抗力极强.孔雀石绿作为一种三苯甲烷类染料，广泛应用于水产养殖业、食品加工业、医药行业等各个领域中.随其广泛使用，该染料对哺乳动物细胞、水生生物和其他有机生命体的致癌致畸效应也凸现出来，引起了科学界的广泛关注.因此，在许多国家和地区，该染料已被立法严禁使用，且被美国食品和药物管理局列为致癌性测试的优先化学物质之一.然而，由于孔雀石绿的生产成本较低、稳定性强且使用效果较好，难以找到合适的

2、替代物，导致很多地区仍在广泛使用该染料，严重破坏了使用地区的生态平衡尽管许多科学工作者已致力于解决由孔雀石绿造成的环境污染问题，例如应用吸附、化学沉淀、光降解、渗透和膜过滤等理化处理技术处理污染水源;然而，由于这些处理方法不仅处理费用高、效率不高，而且在治污的同时容易产生二次污染和难以处置的底泥，因此，极大地限制了其广泛推广使用.生物处理技术作为一种环境友好型且高效低耗的处理手段受到越来越广泛的关注.其中，细菌由于生长速度快，容易获得大量生物量，且易产生大量降解相关酶，对染料的降解效率也较高等优势而受到环境工作者的青睐.本研究的目的在于：广泛筛选浙南地区的MG高效脱色菌株;初步鉴定MG高效脱色

3、菌株为DH-9;采用单因素实验研究菌株DH-9对MG的脱色特性，并采用响应面设计优化脱色条件.2 材料与方法2.1 实验材料 2.1.1 菌种来源供试土样取自浙江温州双屿皮革城和温州大罗山果园，菌株DH-9来源于常年被皮革废水污染的污泥中.2.1.2 试剂孔雀石绿属于三苯甲烷类染料，购自国药集团化学试剂有限公司;革兰氏染色液;TE缓冲液;Tris饱和酚(pH 8.0);氯仿;10PCR缓冲液、DNA 连接酶、dNTPs和Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司);DNA 纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)等.其它生化试剂均为国产分析纯.2.1.3 培养基无机盐培养基(MSM)组成(g L

4、-1)：Na2HPO4，15.13;KH2PO4，3.0;NaCl，0.5;NH4Cl，1.0;MgSO4 7H2O，0.491;CaCl2 2H2O，0.026;pH 7.0.LB培养基组成(g L-1)：蛋白胨，10;酵母膏，5;NaCl，10;pH 7.07.2.纯化培养基组成(g L-1)：在MSM培养基中添加终浓度为200 mg L-1的MG染料.2.2 实验仪器超净工作台;电热恒温鼓风干燥箱;高压蒸汽灭菌锅;全温恒温摇床;电子天平;pH计;高速冷冻离心机;Evolution 260紫外可见光分光光度计;Bio-rad PCR仪、自动凝胶图像分析仪及水平电泳仪等.2.3 实验方法 2

5、.3.1 MG高效脱色菌株的富集、分离和纯化方法将1.0 g土样接入已灭菌的含100 mL MSM培养基的三角瓶中，同时在MSM培养基中添加已过滤除菌的MG母液作为唯一碳源，使其终浓度为20 mg L-1.将三角瓶置于30 、180 r min-1摇床中振荡培养1周后，吸取1 mL培养液转接至新鲜培养基(含40 mg L-1的染料)中，连续驯化、富集.转接多次后，培养物可耐受的染料终浓度为200 mg L-1.用接种环蘸取少许富集培养液，在纯化培养基平板上直接划线分离.在平板上选择不同形态特征的单菌落，重新转接至含200 mg L-1 MG的纯化培养基平板上，转接多次直至获得单一形态的MG脱色

6、菌纯培养物.2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR扩增与序列分析(1)提取基因组DNA：采用酚-氯仿法抽提基因组DNA，具体步骤参考分子克隆实验指南.(2)16S rRNA基因PCR反应：用于菌株DH-9 16S rRNA基因PCR反应的引物为一对通用引物，正向引物BSF8/20：5-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3;反向引物BSR1541/20：5-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3，PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程有限责任公司完成.所得序列用BLAST程序与GenBank数据库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast

7、)中的菌株进行比对，选取一些具有代表性的菌株用于系统发生树的构建.采用软件CLUSTAL X 1.8.3进行DNA序列同源性比较.比对结果用MEGA 4.1软件中的Neighbor-Joining的距离模进行UPGA分析后生成系统发育树.2.3.3 菌株DH-9对MG的脱色特性研究(1)培养基起始pH值对MG脱色的影响：用1.0 mol L-1的HCl或NaOH将2.0 g L-1酵母粉溶液的初始pH值分别调整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0.灭菌后添加过滤除菌的MG，使MG终浓度为100 mg L-1，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V：V)，

8、并于30 、180 r min-1条件下振荡培养.(2)培养温度对MG脱色的影响：分别设定培养温度为15、20、25、30、35和40 .在2.0 g L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加过滤除菌的终浓度为100 mg L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，VV)，并于180 r min-1条件下振荡培养.(3)接种量对MG脱色的影响：在2.0 g L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加过滤除菌的终浓度为100 mg L-1的MG，分别接种1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%(V：V)的菌株DH-9过夜培养物，并于30 、180 r min-1条件下振荡培养

9、.(4)碳氮源对染料脱色的影响实验：将所选碳源(葡萄糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖和蔗糖)分别添加至MSM培养基中，使其终浓度为2.0 g L-1.将所选氮源(NH4Cl、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和L-谷氨酸)分别添加至无NH4Cl的MSM培养基中，使其终浓度为2.0 g L-1.灭菌后添加过滤除菌的终浓度为100 mg L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，VV)，并于30 、180 r min-1条件下振荡培养(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).(5)金属离子对MG脱色的影响：分别向2.

10、0 g L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加终浓度为1.0和2.0 mmol L-1的CuCl2、FeCl3、CaCl2、ZnCl2、MgCl2和MnCl2，灭菌后添加过滤除菌的终浓度为100 mg L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V：V)，并于30 、180 r min-1条件下振荡培养(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).所有实验均重复3次以上，并同时设置对照实验.2.3.4 响应面设计优化菌株DH-9对MG的脱色条件在单因素实验的基础上，采用中心组合试验设计(Central Composite Design，CC

11、D)对MG脱色条件进行优化，培养8 h后测定其脱色率.用标准多项式回归方法，对CCD设计实验数据进行拟合，得到一个二次多项式：式(1)中，Y为预测目标函数;0为常数;i为线性系数;ii为平方系数;ij为交互作用系数.本实验采用五因素三水平CCD设计来研究操作参数对MG脱色的影响，具体设计如表 1所示.2.4 数据统计分析CCD实验设计数据采用Minitab 14.0软件进行统计分析.3 结果与分析 3.1 MG高效脱色菌株的筛选与鉴定经多次富集、纯化培养后，获得了多株对MG有一定脱色能力的菌株，其中菌株DH-9对MG的脱色效果最好，同时，全波长扫描结果显示脱色后有新的吸收峰产生(数据未给出)，

12、加之脱色后菌体沉淀呈现无色，推测该菌株对MG的脱色可能是由生物降解引起的.因此，随后着重对菌株DH-9进行了鉴定.革兰氏染色结果显示菌株DH-9是革兰氏阴性菌，短杆状.菌落呈现圆形，乳白色，半透明，表面光滑湿润.以菌株DH-9基因组为模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20进行PCR扩增，检测PCR产物、回收、纯化后测序，获得1475 nt的DH-9菌株的16S rRNA基因片段，在GenBank中的登录序号为KC736654.该序列经与GenBank中的数据比对后发现，其相似度与Enterobacter aerogenes strain ATCC 13048的相似度达到98%以上，并

13、且在系统进化树中也与该菌株聚类在一起(图未给出)，表明菌株DH-9属于肠杆菌属.3.2 菌株DH-9对MG的脱色特性 3.2.1 pH值和温度对MG脱色的影响培养基初始pH值对MG脱色影响的结果如图 1a所示.培养12 h时，pH值在4.09.0之间的MG培养基脱色率在90%以上.培养24 h以后，pH值在3.09.0之间的MG培养基脱色率均在90%以上，说明该菌株对MG脱色的pH适应性较强，实际应用潜力较大.图 1图 1 pH(a)和温度(b)对MG脱色的影响温度对MG脱色的影响结果如图 1b所示.由图可知，培养12 h时，温度为3040 间的MG脱色率在90%以上.随着脱色时间的延长，当培

14、养时间超过24 h后，所测温度范围内(1540 )的MG脱色率均超过90%，表明该菌株对MG脱色的最适温度范围为3040 ，温度适应性较好.碳氮源对MG脱色的影响如图 2a、图 2b所示.实验结果表明，培养48 h以内时，多数所测试碳源对MG脱色有抑制效应或无显著影响;而当培养时间超过72 h后，多数所测试碳源对MG脱色有促进作用，其中以乳糖、半乳糖和果糖促进效果最为显著，总体而言，所测试碳源中以半乳糖对MG脱色的促进效果最好.与碳源相比，多数所测试氮源对MG脱色的促进效果优于碳源，实验中所测试的氮源均能显著促进MG脱色.有机氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和谷氨酸)比无机氮源(NH4Cl

15、和NaNO3)的促进效果要好，其中尤以酵母粉、谷氨酸和甘氨酸的促进效果最好.图 2图 2 碳(a)、氮(b)源和金属离子(c)对MG脱色的影响 (1.1.0 mmol L-1氯化铜; 2.2.0 mmol L-1氯化铜; 3.1.0 mmol L-1氯化铁; 4.2.0 mmo L-1氯化铁; 5.1.0 mmol L-1氯化钙; 6.2.0 mmol L-1氯化钙; 7.1.0 mmol L-1氯化锌; 8.2.0 mmol L-1氯化锌; 9.1.0 mmol L-1氯化镁; 10.2.0 mmol L-1氯化镁; 11.1.0 mmol L-1氯化锰; 12.1.0 mmol L-1氯化锰) Fig. 2 The effect of carbon(a)，nitrogen(b)resources and metal ions(c)on MG decolorization(1.1.0 mmol L-1 CuCl2; 2.2.0 mmol L-1 CuCl2; 3.1.0 mmol L-1 FeCl3; 4.2.0 mmol L-1 FeCl3; 5.1.0 mmol L-1