两种植物组织特异性基因表达方法分析Word文档下载推荐.docx

1、组织特异性表达技术在植物基因工程中具有一定的应用前景，如利用植物的特定组织细胞合成所需要的代谢产物，还可以用于作物改良的基因工程等.组织特异性表达技术是近年来植物学研究中的一个重要领域（UedaToms等00;Plet等210；Duan等213）。本文主要介绍目前被广泛使用的两种植物组织特异性基因表达方法，即特定启动子驱动法和AL4/AS激活标签法. 组织特异性启动子驱动法 1.1植物组织特异性启动子 启动子是一段位于功能基因5 端上游的DNA序列，包含特定的保守序列,长度因基因而异。启动子上的多种顺式作用元件能识别NA聚合酶,并指导相应类型的RNA聚合酶与模板正确结合,转录起始复合体，控制转

2、录的时空特性和强度，从而精确有效地启动基因的表达。有些启动子，如花椰菜花叶病毒（aMV）35S启动子（Odell等1985）、水稻Acin1基因的Act启动子（lo等1990）和玉米Ubiuiti基因的bi启动子（Chrisne等199）等，其调控的基因不受时空及外界因素的影响，几乎在植物所有组织都有表达,而且表达水平在不同组织部位没有明显差异，被称之为组成型启动子或非特异性表达启动子。 组织特异性启动子,又称为器特异性启动子或细胞特异性启动子，则不同于组成型启动子,其所控制的基因只在或主要在特定的组织中表达.除具有一般启动子的特性外，组织特异启动子还具有一些调控目的基因特异表达的调控元件,这

3、些调控元件的位置、数目、种类决定了目的基因表达的时空专一性，是基因特异表达所必需的.因此,组织特异型启动子已成为转基因研究中常用的外源基因的启动元件。 目前研究人员已经在不同植物中分离并证实了多种具有组织表达特异性的启动子，按照其驱动基因的表达部位,可分为植物营养器，如根、块茎、维管组织和茎叶绿色组织等表达的组织特异性启动子，植物如花器、果实和种子表达的组织特异性启动子（）。根据调控的组织特异性基因表达模式是否受光、热等条件的诱导，又可分为可诱导和无需诱导的组织特异性启动子,比如水稻绿色组织特异表达的Rc基因和LP2基因的启动子要受到光的诱导（Thiny等209;ng等2012）。研究人员也发

4、现，许多植物的内含子也有调控基因时空表达的作用,例如拟南芥花同源基因AGUS中内含子中有增强子序列，它和该基因在花器中的特异区域表达相关（Busc等199）。水稻OsTub基因由个外显子和个内含子组成,在不同的组织如根尖、幼叶和花中有表达,而这一表达模式需要第一个内含子的调控（Jeg等2000）。矮牵牛花ADF1基因中第个内含子会增强其在维管组织的特异性高表达,后来研究证明，这一内含子改变PhAD1基因组织特异性表达的过程是一种转录后调控机制,而且进化比较保守（u等2002；eng等207）。2植物组织特异性启动子的一般研究方法 研究植物的启动子一般采用如下手段,首先通过C扩增法，从植物基因组

5、中扩增已知全部或部分序列的启动子片段，然后通过PLAC（Hi等1999）和ANTCRE（Lsct等02），对得到的启动子片段进行生物信息学分析，预测启动子的核心结构和功能，并在启动子片段的后面融合GS和GFP等报告基因，通过瞬时和稳定的转化，对启动子的表达模式进行分析，最后通过点突变、片段缺失等分析，得到该启动子的核心调控元件（Ellersrom等196;i等200；Kohi和Yangisaa10）。 DNA微阵列的数据给开发新的启动子提供了有利条件。e等（2012）人利用水稻DA微阵列数据库CREP（ColleciofRcExpressinro）,鉴定得到一个只在绿色组织异表达的基因，与水稻

6、基因组数据库中数据进行序列比对发现，该基因编码一个蛋白RC分析表明,DX确实是在叶、叶鞘、茎和穗茎中表达，而在根、花药和胚中都没有表达.通过将编码区上游50b和下游558b序列作为该基因的候选启动子，并提交到PantCAR与已有数据进行比较分析，采用片段缺失分析和凝胶阻滞实验EMSA（ElectrohoeticbitSfts-sy）,得到位于 71至 61的序列5 CGGACA3 （GSE）和位于至的 ATGAACTCAAA-GGCC3 （S）的2个绿色组织特异的顺式调控元件。点突变分析表明这两个顺式调控元件都是正调控因子。 近些年来，由于基因组、转录组学技术和测序技术的快速,使得大规模预测启

7、动子序列和找到发挥作用的调控原件变得可行。Ve等人（20）通过分析拟南芥花粉的4个发育阶段中不同组织的ATH1基因芯片结果，找到了很多花粉特异表达的基因,启动子分析发现约22.%的TCPG类基因启动子中含有一个MEF2基序。差异基因表达也常被用来研究组织特异的启动子,通过cNA-AFL（cDN扩增长度多态性），得到具有差异表达的转录片段，通过这种方法,在马铃薯中得到了一个具有在块茎和匍匐茎等茎组织特异表达的SCCS启动子（Trinade等2003）。转录组测序也有助于非模式物种的差异基因表达研究，Geng等（2014）通过在花生中建立一个基于高通量测序的筛选系统,获得58条根特异和31条种子特

8、异表达的基因片段,其中的55.3%和64%经半定量RT-PCR验证为组织特异表达基因,并从中分离鉴定了一个根特异表达的启动子Ay.1.3植物组织特异性启动子的应用 目前，植物基因工程中使用的多是组成型启动子，其中aM35S启动子主要用于双子叶植物的遗传转化,bi启动子主要用于单子叶植物的遗传转化.虽然这类启动子驱动的基因在转基因植物的不同组织、不同生长阶段均有高水平表达（Ranja等011；Park等2012）,也易于构建目的基因过表达的载体，但在应用中逐渐暴露出一些问题和局限性。例如，组成型的启动子不能用于研究不同类型细胞和组织的功能,而且靶基因在发育过程的错误时间和错误空间过量表达有时会对

9、植物生长发育产生影响（ea等204）.组成型的基因表达可能会造成转基因植物生长延缓,开花延迟,减产,品质降低，甚至不育等现象（Kauga等1999和2004;Pin等2007）。此外,在同一个植物中重复使用同一个组成型启动子驱动多个不同基因表达容易造成基因沉默现象（Palu等196;Vuchert等198;Galili和Hfe2002；Lssard等2002）。 组织特异性启动子则可克服上述缺点，它们可以驱动外源基因在植物发育过程中某一特定的时空表达,使目的基因的表达产物在特定细胞或组织中积累（Jeng等2010）.伸展作用因子（expansn）是调控植物生长过程中细胞壁伸长的主要调节因子。在

10、烟草中用拟南芥根系特异表达的启动子Pk10（tz等001）驱动 型伸展基因TXP23，不仅增加了侧根的数目,而且与5S组成型启动子表达该基因的植株和野生型相比，根系生物量明显提高;在缺水胁迫条件下，与野生型相比，根系特异表达该基因的植株光合速率增加，积累的活性氧（ratiexgecies,ROS）更少，具有较高水平的抗氧化酶的活性，使转基因植株的抗胁迫能力提高（Li等215）。植物发达的根系会增加其抗胁迫能力。水稻根系特异表达的RCc启动子的分离给提高作物抗胁迫能力和作物产量提供了有效工具（Xu等195）。Jong等（10）用RCc3启动子驱动水稻受干旱、高盐和脱落酸等胁迫诱导表达的OsAC1

11、0基因，使其在根中过量表达,转基因水稻根直径是非转基因水稻的。25倍,根的中柱、皮层和表皮都变大;在干旱胁迫和正常条件下,水稻产量与野生型相比都有不同程度的提高。油菜是世界上广泛种植的油料作物，含有高不饱和的C脂肪酸和低芥酸,具有很高的营养价值.Elerstrom等（1996）从油菜中分离得到一个只在胚和胚特异表达的启动子nA利用npA驱动调控不饱和脂肪酸合成的L和L1L基因，使它们在种子异表达，转基因植株种子含油量提高2%，但油分品质没有发生明显改变,也没有影响其他主要的农业性状，而且这些改良与作物生长条件无关（a等2011）。木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生理功能，但对

12、于造纸而言是有害成分，必须从木纤维中去除，木材中的木质素是造纸污染的主要来源.编码咖啡酸酸O甲基转移酶（cffeiacidOthyl-rasferse,T）相关基因的克隆,使研究者可以下调杨树中T的含量，通过RNAi可以减少转基因杨树中约90%T活性，木质素的含量没有受到影响，但使木质素的结构发生明显变化，转基因杨树更加适用于纸浆（aerre等9）.在烟草中用组成型启动子35S表达木质素合成途径相关基因肉桂酰辅酶A还原酶（innayCoredutse，CCR）反义基因虽然可以下调CR基因的表达，减少木质素的含量，但也会影响整个植株的生长发育,出现延迟生长,皱叶等表型；为了克服这样的困难,用维管

13、组织特异表达的启动子LlCCR和LlCAD可能会避免对整个植株造成的伤害，从而实现特异性地降低木材中木质素的含量，减少造纸中为去除木质素而消耗的能源和化学原料（Pashat等211，012）。2 L4/UAS激活标签法 2。GAL4UA系统GA/UAS双因子反式激活体系介导的基因异位表达可实现转基因的空间控制，加上适当的修饰可以实现时空双重控制.rand和er（193）首次在果蝇中构建AL4/AS体系,建立了一个可将任何外源基因以果蝇自身细胞或组织特异的方式被选择性激活表达的系统，并利用该系统来研究果蝇evenkipd蛋白的功能。uyer等（198）将修饰过的GAL4UA系统GA4/C1首次运

14、用到双子叶模式植物拟南芥中，在植物中建立了GAL4/UAS外源基因异位表达系统（图1）。 AL4/UAS是由酵母的GL4基因和GL4基因的上游激活因子序列UAS两部分组成。GAL/UAS系统的建立，首先需要将AL4基因与组织特异性的启动子或增强子相连接，建立以细胞和组织特异性的方式调控表达的GAL转基因系;同时将US与感兴趣的靶基因融合,建立带有UA-靶基因的转基因系。在AS-靶基因转基因系中，靶基因只需和UAS序列相连接，不再需要特定的启动子。因为GAL4蛋白只能与US相结合之后才能调控GAL基因的表达，所以只有将2个转基因系进行杂交，在杂交中，特异性表达的GAL才能以同样的方式调节U靶基因

15、的表达（ran和Pern19）。 为了便于检测GAL4/UAS系统杂交子代中靶基因表达的位置，通常采用的方式为运用GU和GFP等报告基因建立AS-靶基因-报告基因，将靶基因的编码区域与报告基因融合，整合到宿主的基因组中;此U转基因系与G4系杂交后，子代中报告基因由于GAL4与UAS的结合,伴随着靶基因开始表达，通过检测报告基因在不同细胞中的活性，就可方便地对靶基因的表达模式进行更为准确的分析，再对其表达产生的生物学效应做进一步的研究（Wu等2003）。此外，为了方便在建立的AL4系亲本中提前检测GAL在不同细胞组织中的表达，可将报告基因GU或GFP融合到GAL4片段后，随着GAL4随机的插入受

16、体植物基因组中，由于和它邻近的基因表达位置的不同，就可以得到标记了绿色荧光蛋白的表达GAL4基因的株系（Laplae等205）。 2植物GAL4AS体系的建立 2.2。1拟南芥中GAL4/UAS体系构建及应用selof（99）发现由于GAL序列中存在高A/T含量，这些序列会影响植物中mRNA的加工，使GL4不能在拟南芥中表达。为了解决这一问题，他们用VP1代替AL4中的激活部位,建立了一个高AU含量的GA4VP1体系,使得其在植物前mRNA拼接过程中起到很好的识别内含子的作用，从而在拟南芥中高效表达。GAL416随机插入到拟南芥基因组中，其表达依赖于与它邻近的基因增强子序列。为了检测GA4-V

17、P16的表达，他们还将mGFP5基因融合到这段插入片段中,由于和它邻近的基因表达位置的不同,这样就得到标记了绿色荧光蛋白的表达AL4基因的不同细胞。在这些细胞中,筛选收集到了25株只在拟南芥根尖不同细胞中稳定表达的GAL4株系（图2）。 后续研究者可以将感兴趣的目标基因融合到UAS编码框后，得到UAS目标基因系，通过与这些ALVP16系杂交，或者用UA目标基因农杆菌，直接转化GAL4VP6系,获得在根尖不同细胞中稳定表达目的基因的子代，有利于更精确地研究目的基因的功能。除上述最初筛选到的20个株系外，其他研究者还从aseof等建立的GALP16株系中筛选到了新的组织特异性表达株系,如Lapla

18、ze等（2005）筛选得到401株在侧根不同发育阶段特异性表达的株系；Gardne等（2009）筛选得到了4株在气孔保卫细胞特异表达的株系，并发现其中大部分只在气孔保卫细胞表达,且其表达特异性不受外界环境变化。 这些制备并经过验证的细胞和组织特异表达的A4VP株系为研究植物信号传导及其作用机制提供了有效工具。霉素（gibrellin，GA）可以通过促进拟南芥根中细胞的有丝来调节分生组织大小，进而调控根细胞的伸长，维持根生长。为了确定GA是通过分生区中哪些细胞来控制根细胞的增殖,daTo等（08,2009）利用上述Helff等建立的在不同根组织中表达的AVP16株系,包括J51（在皮层和内皮层表

19、达）、2500（内皮层）、J03（根伸长区）和23（根柱干细胞）,使突变基因GAI在这些组织异性表达，结果发现在柱干细胞和伸长区细胞中表达GA后，分生组织大小与野生型一样；而在皮层或内皮层中表达GAI则导致分生组织明显变小,从而说明A是通过促进内胚层中细胞的增殖来控制根分生组织的大小,控制根的生长。同样uan等（2013）利用Haseof等建立的株系研究高盐胁迫对拟南芥幼苗侧根的抑制作用中的细胞特异性。他们在前期研究中发现ABA参与这一抑制作用.为了验证BA的这一调控是否具有组织特异性，首先利用上述Hseloff等建立的在不同根细胞中表达的GA4/UAS株系，特异表达能引起ABA不敏感的突变基

20、因bi11，发现在这一调控中B信号传导主要在内皮层和皮层；然后他们进一步利用内皮层和皮层特异表达的启动子，锁定了内皮层为ABA信号传导的关键场所。 Haeoff等建立的组织特异性表达株系也被用来研究植物对环境因子的响应机理。如lle等（2009）利用在拟南芥根中细胞特异性表达的GAL4UA株系研究钠离子转运蛋白的组织特异性表达对植物抗盐性的影响。选用两种在根和中柱中稳定表达的G4株系，2731（只在主根和侧根的中柱鞘表达）和E256（在主根和侧根的维管柱和中柱表达），使KT基因在这些细胞异表达。发现在根中柱细胞中表达HKT.1会增强钠离子流入的能力,减少钠离子从根中到茎中的转移,并导致茎中钠离

21、子浓度降低,使植物的抗盐能力增强。Plet等（2010）用在表皮和皮质细胞层特异表达的AL4株系发现在拟南芥根表皮和皮层特异表达T1会增加茎中钠离子的积累。 2.22水稻GAL4UAS体系构建及应用Wu等（20）在水稻 中花1 和 中花1 中建立了GL4-16/AS体系,将经过修饰的GUS报告基因（GUSPlus）放在6 UAS启动子上,用来检测基因在不同位置的表达，得到了约3143株F1代有GS标记的单株（表2）.通过用GL4V16编码区的引物进行PR扩增和GALVP16特异探针进行核酸杂交验证,大部分代GAL4株系都有T-DNA插入，其中约有一半为单插入。由于S标记需要经过组织化学染色、固

22、定等步骤才能确定表达位置。Johsn等（200）以GP为报告基因,得到具有不同表达强度的GF转化株,在水稻中建立了一个可快速、跟踪检测的GL4/UAS系统。let等（10）利用Jonson等人建立的水稻GALGFP系统中在木质和皮层有GFP特异表达的3和AOHB03株系，将拟南芥HT。1基因在这些GAL4系异表达.发现当用盐胁迫处理时,与对照相比，水稻皮层异表达HT1.1的转化株（AHB0）干重明显增加，根中钠离子增加，茎中钠离子浓度变低;而木质部中1.的特异表达转化株（ASF0）干重减轻，茎中钠离子浓度升高，而根中降低.这些结果与在拟南芥中得到的结果相同，说明钠离子在特定细胞中的转运与植物抗

23、盐性间的关系在拟南芥和水稻中非常相似。可见组织特异性表达这一研究工具在粮食作物的重要农艺性状研究中具有广阔的应用前景.3讨论与展望 虽然现在已经分离得到了许多细胞或组织特异的启动子,但对于多细胞和组织器复杂的高等植物来说，还是远远不够的，而且启动子具有物种特异性，在不同物种中其驱动的基因表达位置可能存在差异。目前,由于转录组、蛋白质组和基因组测序技术的，给分离更多的特异性启动子提供大量数据,尤其是转录组数据的分析可以帮助我们更快的认识基因在时间和空间的表达模式,进而开发更多新的有用的特异性启动子（-na等24；eenko和Krotko20），实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控，使

24、其在可控条件下为基础研究和作物性状改良创造更多可能（Jeon等21;Y等013；Li等20）。 由于GA4-S系统在建立时A4基因是随机插入基因组的,这就使它存在不可避免的缺点：（）单一株系在多个不同细胞和组织中都有目的基因的表达；（2）这种多细胞表达的组合是随机的，强弱不同，不是研究想要的组合;（3）得到的不同组织特异的群体可能不能完全包含研究所需要的全部细胞类型。因此，在研究特定基因的功能或信号响应和应答的特异组织定位时，不仅需要筛选分离和验证更多细胞或组织特异的启动子，建立和扩大组织特异的G4/UAS群体,优化得到有规律或实验所需的细胞表达组合,还要将组织特异的启动子和GAL4/S株系结

25、合起来,利用各自特点先通过在多个不同细胞和组织中都有目的基因表达的GL/U株系,将信号响应目标细胞定位到很小的区间（一到两种细胞类型），再通过已知的细胞特异的启动子驱动目的基因在其表达，最终将响应特定信号的细胞类型确定下来. 目前文献中报道和广泛使用的4/AS系统大多是以果蝇（Ban和Pein993）、老鼠（Mallo2006）、斑马鱼（Haprn等200）、拟南芥（Halof1999）和水稻（Wu等003）等模式生物建立的，主要用于研究特定基因的功能或者信号响应的特异组织定位，或者在特定细胞或组织中表达致死的基因，达到切除靶细胞的作用（Bran和Perrn193）.随着测序技术和遗传转化技术的进步，使得L4/UAS技术日益成熟，我们有望在更多的动植物中建立这种细胞和组织特异表达的库，用于改良作物的产量和品质，疾病治疗等。