体内药分文档格式.docx

1、1. 与血浆结合的程度影响药物分布在体内组织的方式。2. 当解释化合物的PK谱时，应考虑治疗剂的蛋白质结合度。3. 化合物的高蛋白结合对药物毒性具有重要的临床效果。、治疗药物监测（Therapeutic drug monitoring ,TDM）在药代动力学原理的指导下，应用现代先进的分析技术，测定血液中或其他体液中药物浓度，以用于药物治疗的指导与评价。、有效血药浓度范围（Therapeutic Range）最低有效浓度（minimum effect concentration, MEC）与最低中毒浓度（minimum toxic concentration, MTC）之间的血药浓度范围。、T

2、DM有助于调节剂量以产生期望的响应：1. 狭窄的治疗窗口（地高辛，奎尼丁）2. 高毒性小剂量（地高辛）3. 来自相同剂量的血浆浓度的个体间变异是不可预测的（苯妥英，茶碱）4. 在某些医疗条件（肝，肾，胃）服用药物5. 不符合治疗、ig（灌胃），im（肌内注射），iv（静脉内注射），sc（皮下注射），ip（腹膜内注射）或腹腔。第二章 生物样品的制备、样品选取原则1. 应根据不同的分析目的要求进行选取。2. 取样品应能够正确反映药物浓度与药效之间的关系，具代表性。3. 样品易于获取，便于处理、分析。、血浆（plasma）：加抗凝剂（如肝素、枸橼酸、草酸盐、EDTA等）于全血中，离心或沉降后的浅黄色

3、上清液，含纤维蛋白原。血清（serum）：全血自然放置，离心或沉降后的浅黄色上清液，不含纤维蛋白原。注意：全血-环孢菌素需以全血测定。防止溶血措施： 容器应干燥 避免剧烈振摇、尿样（urine）1. 尿药分析的作用 1 研究药物剂量的回收 研究药物肾清除率 测定药物代谢类型2. 尿药分析的优缺点优点：浓度高、收集量大。缺点：1 尿药浓度变化大，需测定一定时间内尿中药物的总量（时间尿体积浓度）；2 尿药浓度与血药浓度的相关性较差；3 取样时间难以掌握；4 尿液是一种良好的细菌培养基，不易保存。3. 尿样的特点尿中药物大多呈缀合状态，测定前需将缀合的药物水解游离。、预处理方法的考虑因素1生物样品的

4、类型非均匀样品：均匀化 、去蛋白 去蛋白处理1. 加入与水互溶的有机溶剂目的：使蛋白变性沉淀，离心去除。局限性：产生稀释，使上清液药浓偏低；内源性杂质多。2. 超滤离心法和平衡透析法特点：半透膜原理,测定游离药物不破坏样品中的组分（无损伤性）透析法所需时间较长3. 其它方法（1）加酸性沉淀剂如：10%三氯醋酸、6%HClO4、 5%HPO3等V（血浆）:V（酸液）=1:0.6（2）加入无机盐（NH4）2SO4 、NaCl等进行盐析V（盐溶液）:V（血浆）=2:1（3）加入重金属盐类CuSO4-NaWO4、 ZnSO4-NaOH等均匀样品： 血样：除蛋白、提取唾液：离心沉淀除粘蛋白尿液：缀合物水

5、解2药物（代谢物）的理化性质与浓度范围3药物测定的目的4分析技术与仪器、生物样品的萃取与浓集1溶剂萃取法（液液萃取，liquid-liquid extraction，LLE）1. 目的：纯化（消除干扰）、富集（提高灵敏度）双重目的。2. 如何提高萃取效率？适合的提取溶剂 较大量的提取溶剂体积 增加提取次数3. 影响因素1） pH选择依据：被提取组分（药物）的pKa值；pH = pKa + logAHA一般原则： 酸性药物在酸性pH介质中提取；碱性药物在碱性pH介质中提取。实际情况： a、多数情况下采用碱性pH介质提取。b、高度电离的极性化合物，采用“离子对”技术提取。2） 提取溶剂的选择考虑极

6、性、沸点、毒性。在满足提取需要的前提下，尽可能选用极性小的溶剂。采用混合溶剂提取常常可以提高提取效率。3） 提取技术提取次数 避免乳化内标的加入：为减少操作过程中多处引入的误差，用色谱法分析时，多在提取前加入内标，使内标物与样品组分在同样条件下进行预处理。4） 溶剂蒸发常用方法：a、减压蒸发b、氮气流保护下蒸发容器：尖底离心管2固相萃取法 （solid phase extraction，SPE）基本原理:将样品溶液通过预先填充固定相填料的柱子，待测组分通过吸附、分配等形式被截留，然后用适当的溶剂洗脱，达到分离、净化和富集的目的。3.固相微萃取（solid phase micro-extract

7、ion， SPME）原理：利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用，将组分从试样基质中萃取出来，并逐渐富集，在进样过程中，通过解吸由色谱仪进行分析。萃取涂层：有机物的萃取符合“相似相溶”原则, 不同的涂层萃取不同的待测物。非极性涂层如聚二甲基硅氧烷（PDMS）：对非极性物质如烃类效果良好;极性涂层如聚丙烯酸酯（PA）：对极性物质如苯酚和羧酸类的吸附非常有效第三章 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）采用高压输液泵将不同极性的流动相泵入装有固定相的色谱柱进行分离测定的色谱方法。、基于速率理论的 van Deemter方程

8、（简式） ： H = A + B / u + C u、基本组成输液系统 进样系统 色谱柱 检测器 数据处理系统1. 输液泵结构：往复式柱塞泵 流动相的准备：脱气和过滤，纯度的要求。洗脱方式：等度洗脱 梯度洗脱2. 进样系统 六通阀进样 准确进样自动进样器3. 检测器（1）紫外检测器（ultraviolet detector，UVD） 工作原理：Lambert-Beer定律 适用对象：有紫外、可见吸收的物质 光源：氘灯、钨灯 分类: 可变波长检测器（190-800nm，或200-600nm）二极管阵列检测器 （photodiode array detector, DAD） 1 与普通紫外检测器相

9、比，DAD可得任意时间的光谱图，同时对流出组分进行紫外扫描，定性功能更强，有利于复杂样品的定性。2 DAD具备色谱峰纯度鉴定、防止漏检等功能，选择性优于普通紫外检测器，特别适用于提取纯品的检测。3 DAD灵敏度略低，不利于体内样品的低浓度测定。4 只能检测有紫外吸收的物质，且流动相的选择有一定限制，低于210nm色谱图噪音较大。、HPLC常用分离模式1.化学键合相色谱法（Chemical bonded phase chromatography， BPC） 化学键合相：固定液与载体（担体）间通过化学反应键合成固定相1 分类 （按键合的有机分子官能团的不同） 非极性键合相（反相键合相）：载体表面键

10、合极性小的烃基。eg:ODS流动相选择原则：黏度小；紫外吸收本底小，对样品有较宽溶解范围；被测组分保留时间合适 极性键合相：载体表面键合的是含有某种极性基团的有机分子 离子性键合相2. 反相离子对色谱1 离子抑制色谱法在反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的2 反相离子对色谱分离原理流动相中加入反离子，使与组分离子形成疏水离子对，在固定相上有适宜的保留。 适用范围：强酸（碱）性物质3 反相离子对色谱条件选择固定相： C18 、C8柱流动相：含一定量反离子、一定pH值的水/缓冲盐-甲醇体系反离子的选择 酸性药物（A-）

11、：季胺盐作为离子对试剂（pH7.0左右） 碱性药物（B+）：烷基磺酸/硫酸盐作为离子对试剂（pH3.5左右）pH值的选择：使被测物完全离解，尽可能都形成离子对。3. 离子对提取法（ion pair extraction method）一些酸性或碱性的有机药物在体液中呈离解状态，变成亲水性极强的带电荷离子，即使控制pH值也不能抑制它们的电离，不能用有机溶剂从体液中提取出来。对于呈离解状态的药物，当添加与药物离子呈相反电荷的反离子（counter ion）时，即可成为具有一定脂溶性的离子对，用有机溶剂将其从水相中提取分离。4.内表面反相固定相 （Internal Surface Reversed

12、Phase，ISRP）在多孔硅胶的外表面键合亲水基团，内表面键合疏水基团。ISRP 的色谱条件缓冲液和低浓度调节剂-甲醇、乙腈pH: 适合蛋白洗脱柱温不易过高直接进样，等度或梯度洗脱；柱切换进样。、定量分析方法1 外标法（external standard method）1 用纯物质配制一系列不同浓度的标准试样，在一定的色谱条件下准确定量进样，测定峰面积（或峰高），绘制标准曲线。在完全相同的色谱条件下对样品进行测定，根据所得的峰面积（或峰高），带入曲线求出被测组分的含量。2 缺点：操作条件变化对结果准确性影响较大，不适用于有复杂预处理步骤的体内药物分析。2. 内标法（internal stan

13、dard method）1 将一个已知准确含量的化合物加入样品和标准品中，进行提取、蒸发、溶解、进样等一系列操作，根据被测组分与内标物的峰高（或峰面积）之比计算被测物的含量。2 优点：能够减少仪器和预处理操作过程所带来的各种误差。不要求各组分全部出峰，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大，适用于体内药物分析3 体内药分内标物的选择1）内标物的化学结构最好与被测物相近，且化学性质稳定。2）内标物与被测物在样品液与萃取溶剂之间的分配系数相近。3）内标物与被测物的RS要适合（两峰相近，但不重叠）4）不能采用内源性物质或被测药物的代谢物作内标；同时服用或经常服用的药物也不宜选作内标。第三章

14、气相色谱（gas chromatography,GC）、特点1、高选择性： 对理化性质极为相似的组分有较强的分离能力2、高效率：百万级别的理论塔板数3、灵敏度高：检测限可达到纳克级别或者更低4、分析速度快：几分钟到几十分钟5、应用范围广：广泛应用于气体和易挥发性物质或可转化为易挥发性物质的样品的定性及定量分析、组成气路系统、进样系统、分离系统、温控系统、检测和数据处理系统、分类1.填充柱气相色谱法：（packed column）:由不锈钢或玻璃材料制成，内装固定相， 内径约2-6mm，长约0.5-6 m。气-液填充柱气相色谱法：填充的是涂布了固定液的担体，固定相为（载体+固定液）。分配气-固填

15、充柱气相色谱法：填充的是石墨化炭黑、氧化铝、高分子微球等吸附剂或分子筛材料，此时固定相为吸附剂或分子筛材料本身。吸附2、毛细管柱气相色谱法：（capillary column）:又称空心柱或开管柱（open tubular column），柱材多为熔融硅石英管。内径约0.1-0.53mm，长度数米至数百米。1 壁涂毛细管柱 2 交联毛细管柱：空心毛细管柱内壁涂布了固定液后，在通过化学反应使固定液原位相互交联或键合到毛细管壁上，从而使固定液固定化。1） 特点：a） 固定液膜的稳定性大大提高b） 固定相流失大大减少、易清洗c） 使用温度范围更宽（但聚酰亚胺涂层在380C上不稳定 ）d） 由于交联或

16、键合的作用，使得固定化的固定液挥发度很低，可降低检测的干扰，提高灵敏度。、气相色谱的固定液（1）化学稳定性好，在操作温度下不降解；（2）化学惰性，不与样品组分、担体、柱材料及载气发生不可逆反应；（3）蒸气压低（在操作温度下一般低于0.1mm Hg） ，热稳定性好，否则固定液易流失；（4）对样品组分有一定溶解度，否则样品组分不被保留而得不到有效分离；（5）对样品组分具有良好的选择性，即对沸点相近或相同的物质要有尽可能高的分离能力，不同的组分有不同的分配系数，以增加分离能力；（6）对担体要有湿润性，以利于在担体表面形成均匀液膜，增加柱效。1.担体：又称载体或固体支撑物，是支撑固定液的惰性多孔固体颗

17、粒。 （载体 + 固定液） 固定相担体应满足的条件 化学惰性，在使用温度下不与样品或固定液发生反应； 比表面积大，良好的孔穴结构，颗粒规则均匀，利于固定液的均匀分布； 机械强度好，处理过程中不易破碎； 热稳定性好，对固定液具有较好的润湿性。第五章 免疫化学法 、放射免疫分析法（radioimmuno assay, RIA）1.基本原理1 当抗体初始浓度Ab0低于标记抗原初始浓度Ag*0和非标记抗原初始浓度Ag0之和时，非标记抗原Ag将与标记抗原Ag*竞争结合抗体Ab，分别生成非标记抗原-抗体复合物Ag-Ab和标记抗原-抗体复合物Ag*-Ab。2 当Ab0和Ag*0都已确定时，如果Ag0低，则生

18、成的Ag*-Ab多（其浓度B高），剩余的标记抗原Ag*少（其浓度F低），B/F值较高；相反，如果Ag0高，则B低，F高，B/F值较低。3 在测定时，Ab0和Ag*0都是已知的。以B/F值为纵坐标，以标准溶液非标记抗原初始浓度为横坐标制作标准曲线，得到回归方程，在相同条件下测定未知非标记抗原的B/F值，即可用回归方程求得未知非标记抗原的初始浓度。、抗原（Antigen）：指能刺激免疫活性细胞产生抗体，在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。免疫原性：指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。即指抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性

19、。抗原性：指抗原与其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。一般来说，抗原的分子量愈大、化学组成愈复杂、立体结构愈完整以及与被免疫动物的亲缘关系愈远，则抗原性愈强。抗体（antibody）：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞等增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。共同抗原（common antigen）：两种不同生物间存在相同或相似的抗原决定簇，称为共同抗原。交叉反应（Cross Reaction）：由共同抗原刺激机体产生的抗体分子可以和不同生物间相同或相似的抗原决定簇结合，在实验条件下，抗原-抗体的反应常会受到结构相近似的其它药物或化合物的干扰，

20、影响待测药物（抗原）与抗体的结合。第六章 其他、分析方法的建立1.建立之前做好文献总结：充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰，适用于实际生物样品测定。2.初步拟定分析方法后进行一系列试验工作选择最佳分析条件同时验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品3.分析方法的建立步骤1 检测条件的筛选 2 分离条件的筛选1纯品进行测定：基本条件的摸索2空白生物基质测定：背景检查，确定空白生物基质是否有干扰3以水代替空白生物基质，加标准液后测定（可略）了解提取率、检测浓度、确定萃取条件、pH、挥发浓缩等4模拟生物样品试验-空白生物基质加入标准液测定内源性干扰检查、标

21、准曲线建立、回归方程、回收率等5实际生物样品测定：代谢产物干扰情况检查、准确度：用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与真实浓度的接近程度1.相对回收率（relative recovery，RR），或方法回收率 测定值M （measured）平均值与理论浓度（加入值）A（added）比值2. 绝对回收率（absolute recovery），或萃取回收率萃取回收率与方法回收率的意义不同萃取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失方法回收率采用标准曲线是否可准确计算生物样品中药物浓度、电喷雾电离（Electrospray ，ESI） 1. 形成带电液滴2. 溶剂蒸发和液滴碎裂3. 形成气相离子大气压化学电离 （Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI）1.快速蒸发2.气相化学电离（电晕放电）