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1、例如,双链d（ACGG/CCGT）的G是:G（ACGG）=G（AC）+G（CG）+G（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0 kcal/mol 此计算方法特别适用于测定其3末端会形成双链的引物的相容性。也可以用来计算发夹环结构的G。不过,这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol;4个时为4.5;5个为4.4;6个是4.3;7和8个为4.1 kcal/mo1。选择引物的一般规则 设计和选择引物时有5个要素必需注意。1 引物的3末端不互补引物的3末端一定不能有很大的互补性,因为它们的互补会形成引物二聚体,这就会带来很大的问题,例如合成出非专一的

2、产物,极大地减少所期望产物的得量。有实验表明,3末端双链的G是0- 2 kcal/mol时,PCR 产量几乎达到百分之百,随着其绝对值的增加产量逐渐下降,在-6时只有40%,到-8时少于20%,而-10时,接近于0。虽然产量还取决于其他参数,如退火温度、引物的专一性等等,但是用Taq聚合酶操作时,由于它的工作能力很强,能够在很短的时间内就识别3末端互补的双链区并发动聚合反应,即使3末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用,所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。2 引物分子内不互补应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环,其G为- 3 kcal/mol的自

3、身互补引物也可以得到不错的结果,但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦,即会引发引物内部的延伸反应,减少了参与正式反应引物的数量。当然,如果发夹环在5末端对反应就没有多大的影响了。3 引物的组分、解链温度和长度普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实,这是不对的。以人基因组DNA为模板,用81% AT的引物可以产生单一的,专一的,长250 bp,含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度,PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。要知道,更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小,PCR的效率越高。因为D

4、NA的解链温度也取决于它的长度,所以有的研究者喜欢设计很长,而不求它很稳定的引物。可是,引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补,因此,一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp,选用短的（1618 mer）的引物:若产物长5 kb,则用24 mer的引物。有人用2023 mer引物得到40 kb的产物。但是,引物较长时,如果不借助引物选择的计算机软件帮助,就很难确定一对引物是否会形成二聚体,是否有自身互补性以及专一性如何。于是,用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板,得出非专一产物。通过下述的观察内部稳定性原理可以极大地减少这种问题。4 引物的

5、内部稳定性在DNA测序和PCR中最好用5末端稳定（如GC含量较多）,而3末端不太稳定（如AT含量较多）的引物,这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于,接近或在3末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成,所以不会产生假产物。因此,为了有效地引发反应,引物的5末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反,带有稳定的、GC丰富的3末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对,只凭借其3末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应,产生非专一产物。如果用3末端低稳定性的

6、引物,反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板（底物的复杂性、Tm、产物长度）和退火的温度与时间。所以,有时3末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是,无论如何,寡核苷酸3末端最后5个核苷酸的稳定性小于-9 kcal/mol的,通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3末端越不稳定,假引发的可能性越低。5 引物的唯一性为了放大单个的、专一性DNA片段,选用的引物序列就应当是唯一的,即在模板中没有重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配,但是,通常见到的引物的3末端往往都有67个没

7、有什么个性的核苷酸。如果假引发的位点正好在放大区的内部,那麻烦就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率,就容易产生非专一产物。如果用哺乳动物基因组序列作为模板,可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知,应当避免使用同寡聚物（如AAAAAA）和二核苷酸重复（如ATATAT）。可以这样理解:在引物模板中所谓自由能是指引物同模板结合后形成稳定结构所释放的能量,二者越稳定释放能量越多,自由能负值越高（绝对值越大）,要分开二者就得吸收更多能量。在引物设计中,要求3末端不要太稳定,防止错误引发的几率增加,因此要求自由能低于-9kcal/mol。综合上述:你所谓-4kc

8、al/mol,应为2、3非5、6看绝对值。从能量转移角度解释就明白了。请高手指正,谢谢。引物设计时自由能（G）表示什么呢?它的绝对值越大是不是表示双链结构内部碱基对的相对稳定性越大呢?恳请各位指点 越负越稳定。意思就是反应形成时放出的能量越多。放出的热量越多就越稳定。实时荧光定量PCR中两种引物的设计有什么要求?参照以下real-time PCR引物设计原则:1.最好位于编码区5端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。4.G+

9、C含量在40%60%之间,45-55%最佳。5.碱基要随机分布,尽量均匀。6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5端可以修饰。9. 3端不要以A结尾,3端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C,A/G 连续结构（2-3个）。10. 引物3端要避开密码子的第3位。11.引物整体设计自由能分布5端大于3端,且3端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染,最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同

10、源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列,与需要扩增的目的片段长度相似。16.TM值在55-63度之间。17. .引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。引物设计时自由能的含义是什么?有问题的引物怎么筛选?1.我用primer5.0设计引物时,无论怎么设条件,出来的不是有二聚体就有发夹或错配,我查了很多帖子,都说有时不可避免,只要自由能的值低的就好,那怎么看自由能值的高低呢,自由能的值都是负值,比较大小时负值有什么意义吗?oligo使用方法里说“发卡结构和二聚体的能值越低越好,这两项结构的能值以不超过4.5为

11、好”那这个数值是说的-4.5吗?如果A是-10.5,B是-0.4,那么是不是可以说A算低的B算高的?还是看绝对值（A高B低）?2.另外,我想问问做RT-PCR的引物,什么比较重要,什么不太重要?比如设计的引物有的有发卡有的有二聚体有的还有错配,这三种情况有没有个优先考虑的因素?还是看它们各自的能值影不影响?现在急需做引物设计,请哪位高手帮帮忙,谢谢了!1、引物设计原则中指出:引物3端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发;3端也不能有形成任何二级结构可能;引物自身连续互补碱基不能大于3bp;两引物之间不应该存在互补性,尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成,一般

12、情况下,一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。2、G值是指DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,G值越大,则双链越稳定。比较G值应当看绝对值,如A是-10.5,B是-0.4,则A比B高。不超过9）的引物。引物3 端的G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。3、引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）,引物3 端的G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应,选3 端G 绝对值不超过9的引物。想把引物合成的比较好,除了前引物和后引物的Tm不能相差太大,我们还要重点考

13、虑以下因素:一、GC含量 引物的GC含量一般为40-60%,以45-55%为宜,过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大）,以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出,则在引物的5端增加As或Ts;而如果A-T比例过高,则同样在5端增加Gs或Cs。但也有认为:原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的,以人基因组DNA为模板,用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp,含有70% AT的产物。完全没有必要复杂

14、地去计算产物和引物的解链温度, PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。产物中GC含量最好大于引物中的GC 含量。二、Degeneracy 多义性 当设计多义引物时应尽量减少引物多义性,这样会带来更好的特异性,应尽量避免3末端的多义性,因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。三、3 End Stability 3 末端稳定性 引物稳定性影响它的错配效率,一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。如果引物3 稳定性强,有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配,形成非特异性扩增条带（secondary bands） 。而3 末端稳定

15、性低的引物较好的原因是在引物发生错配时,由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。四、GC Clamp GC钳 引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端。这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。五、Secondary Structures二级结构 二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量,发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力,从而降低扩增效率,形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。六、Hairpin发卡结构 发卡结构

16、的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构,并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量,如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应,如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。七、Dimer 二聚体 引物之间的配对区域能形成引物二聚体,它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物,二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成,如果配对区域在3 末端问题会更为严重,3 末端配对很容易引起引物

17、二聚体扩增。八、False Priming 错配 如果引物可以结合除目的位点外的其他区域,扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布（smear）。3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对,在使用引物设计软件时,您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。九、自由能问题（如何根据自由能判断引物质量） 1、G值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下,引物的G值最好呈正弦曲线形状,即5端和中间G值较高,而3端G值相对较低,且不要超过9（G值为负值,这里取绝对值）,如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3末端双链的G是0-

18、2 kcal/mol时,PCR产量几乎达到百分之百,随着其绝对值的增加产量逐渐下降,在-6时只有40%、到-8时少于20%、而-10时接近于0。2、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5,否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行,与二聚体相关的一个参数是碱基的分布,3端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定,越不符合要求。与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环,其G为-3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果,但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦,即会引发引物内部的延伸反应,减少了参与正式反

19、应引物的数量。十、产物需要测序的PCR引物的设计问题 在DNA测序的PCR中最好用5末端稳定（如GC含量较多）,而3末端不太稳定（如AT含量较多）的引物,这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。无论如何,寡核苷酸3末端最后5个核苷酸的稳定性小于-9 kcal/mol的,通常就是专一性的探针或引物。顺便说一下,如果新手刚开始接触引物设计,推荐使用Primer Premier 5.0,因为它界面简单,易学易用;如果你想把引物设计得尽善尽美,公认的首选软件是Oligo,其次我认为是DNAstar。Oligo功能强大,所以使用起来就没有Primer Premier 5.0那么简便。先用Primer Premier 5.0设计,然后把设计好的引物拿到Oligo里去检测这对引物的优劣,我想这对大多数引物设计者是一个不错的选择!（上海沪宇生物科技有限公司） 原文地址: