TUNEL说明书Word文档下载推荐.docx

1、标记溶液 反应缓冲液，内含核苷混合物 1550l3 黄色转换剂-POD 荧光猝灭抗体，绵羊Fab片段，马-罗卜组合超氧化物 直接使用 3.5ml试剂盒外自备仪器和试剂出上表所列试剂外，实验者需制备系列溶液。下表列出了在不同实验步骤中所需要的试剂。在每步操作前都给出了详细的说明。步骤仪器试剂样品制备（3.2） 细胞粘附，涂片和细胞离心涂片器的制备（3.2.1） 低温保藏组织（3.2.2.2） 清洗液：磷酸盐缓冲液（PBS） 结合液：含3%H2O2的甲醇 固定液：4%的多聚甲醛PBS液，pH7.4，无菌制备 渗透液：0.1%的柠檬酸钠溶液（含0.1% Trition X-100），无菌制备【6】石

2、蜡包埋组织（3.2.2.1） 二甲苯和乙醇（100%，95%，90%，80%，70%，溶解于双倍蒸馏水中）PBS 蛋白激酶K，不含核酸酶的工作液：10-20g/ml in 10mM Tris/HCl, pH7.4-8.0其它处理方法 渗透溶液：0.1%的柠檬酸钠溶液（0.1% Triton X-100），无菌制备 胃蛋白酶（0.25%-0.5% in HCl, pH2.0）或者胰蛋白酶（0.01N HC，不含核酶l） 0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波辐射用标记步骤（3.3）主观控制（3.3.1） 小球菌核酸酶 重组型DNase ，一级细胞粘附、爬片、涂片及组织（3.3.2） 帕拉玢膜或者

3、盖玻片 湿化腔坚硬组织（3.3.3） 塑料罐 微波 柠檬酸钠缓冲液，0.1M，Ph6 0.1M Tris-HCl, pH7.5 （3%BSA, 20% 正常牛血清） 单分子转化（3.4） PBS洗液 DAB金属增强试剂或者其它可替代试剂 粘合试剂2 引言2.1 产品描述实验原理在细胞凋亡过程中，基因组DNA 会断裂产生双链、低分子量的DNA 片段和高分子量的单链DNA 断端（缺口），这些DNA 链缺口可以利用酶标记核苷酸3末端方法来识别。描述1末端脱氧核糖核酸转移酶以非模板依赖的方式催化自由的3-OH末端核苷酸聚合反应，从而标记DNA 链断端缺口。2马-萝卜的氧化酶被整合到绵羊的Fag片段上，

4、并被带有荧光的抗体标记。当发生反应后，标记的细胞就能够在光镜下被观察到。3反应结束后，在光镜下检测分析被染色的细胞。应用 原位细胞凋亡检测试剂盒具有准确、快速、简单、非辐射等特点，可以用来对细胞或者组织中的单个细胞进行检测并定量，因而次法被用在很多分析系统中，例如： 在基础研究和日常病理中检测冰冻和福尔马林固定的组织切片。 在肿瘤研究和临床癌基因研究中确定某些恶性肿瘤对某种药物的敏感性。 通过双染色操作，确定经历死亡的异常增生细胞的分型。专一性TUNEL反应可以更好的标记通过凋亡产生的DNA链末端，因此就可以区分出凋亡与坏死，以及由抗肿瘤药物或者放射诱发的初始DNA链末端。试验干扰假阴性：在某

5、些形式的细胞凋亡中，DNA逃逸酶切或者不完全（37）。固定障碍物例如胞外的成分可以阻止TdT到DNA的通路，因而导致假阴性。假阳性：在坏死的末期可能产生一些额外的DNA碎片（4,38）。在具有快速增值和转移能力的细胞中，DNA链裂解也可能比较突出，从而导致假阳性。为了确认细胞凋亡，应仔细检测目标细胞的形态。凋亡具有很特征的形态学改变，因此在干扰导致结果模糊的原位凋亡中，细胞形态学的确证尤其重要。样品 细胞涂片的制备 贴壁细胞的腔室斜面培养（31） 冷冻、福尔马林固定的、石蜡包埋组织部分（1，25，26，29，30，32-34,36,39）分析时间2-3小时，终止培养，固定，细胞渗透化以及组织制

6、备。实验次数次试剂盒设计使用次数为50次。试剂盒的稳定性及保存保质期内的为开封的试剂盒储存在-1525下储存及稳定性TUNEL反应混合物TUNEL反应混合物应当现配现用，并立即保存冰浴中转移物-POD解冻的转移物-POD溶液储存于2-8的环境中（最长可保藏6月）不宜冷冻优点请参照下表特点敏感单分子水平上检测出早期凋亡专一优先标记凋亡（1,2,6）快速操作时间段（2-3h）方便试剂以最稳定和适宜的浓度形式提供无需稀释步骤灵活 适于固定的细胞和组织，可以使样品收集、储存和运输成为可能 应用双标可以区分凋亡细胞的分型和不同时期质优每一批产品都经过严格的检查2.2 背景知识细胞死亡细胞两种不同的死亡方

7、式，凋亡与坏死，可以通过死亡细胞形态学、生物化学和分子生物学等方式进行区别。细胞程序化死亡或称凋亡是真核细胞死亡的最常见的形式，它是细胞维持自稳状态而具有的一种生理性自杀机制，是发生于正常细胞的一种正常死亡（8,9）。一般情况下,历经凋亡的细胞其细胞核与细胞浆会发生一些特征性变化，包括核膜快速皱缩及细胞核的崩解。这种胞核的塌陷与钙依赖的内源性核酸内切酶（10,11）的活化而导致的染色体和DNA 被裂解成寡核苷酸DNA 片段密切相关（37）。凋亡凋亡是许多正常的生理过程所必需的，包括免疫系统（12,13）的成熟和作用机制、组织器官和肢体的发生（14）、神经系统（15,16）的发生等过程。在许多病

8、理条件下，凋亡机制的调节失衡（17）起很重要的作用，包括出血、中风、心脏病、癌症、爱滋病、自身免疫缺损和中枢神经系统的退行性变等（18-20）。在癌基因的研究方面，由于细胞凋亡可由抗癌药物、放射及高热等启动，并且肿瘤细胞具有由于一些癌基因表达即能启动凋亡的内在特性，因此细胞凋亡已引起人们的广泛重视（21）。凋亡的检测检测凋亡细胞的方法有数种（22-24）。细胞凋亡过程中核酸内切酶的活化是关键的过程，导致核DNA 被裂解成寡核苷酸大小的片段。因此，这个过程被用于检测凋亡，在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的“DNA 梯形带”。但是，这种方法既不能检测单个细胞水平的凋亡，又不能提供细胞发生凋亡所处的组织位

9、置和细胞分化状态等方面的信息。这一切可以由凋亡的原位酶标记方法来完成。DNA 聚合酶和末端脱氧核酸转移酶（TdT）用来标记DNA 链断端的核酸（1-6,25-36,41），应用TdT 进行的末端反应又称为ISEL 或TUNEL 技术（1,6,31,33），它与ISNT 相比具有以下优点： 与ISNT相比，TUNEL标记细胞凋亡更为灵敏，从而增加其灵敏度（2,4）。 TUNEL技术下的核苷整合技术更快（2,4）。 优先标记发生凋亡的细胞，而不是坏死的细胞。因此可以区分出坏死或者因药物或放射作用而引起的初期DNA裂解（3,4）。3 实验操作及耗材下列描述的操作过程已由R.Sgonc 等开发并已发表

10、，这种简单快速的方法最突出的优点就是使用了荧光标记的dUTP来标记DNA链末端，这就允许在TUNEL反应后直接用荧光显微镜检测DNA片段，而后在进行POD荧光结合。3.1 分析流程3.2.1 细胞贴壁、涂片的制备其它所需试剂 渗透液：操作下表描述了细胞固定、内源性氧化镁的结合以及细胞渗透提示：固定和渗透额外的两个样本作为阳性和阴性对照在15-25下用新鲜的固定液固定风干的细胞1hPBS清洗30min1525下，结合液处理10min4PBS冲洗斜面5渗透液冰浴（2-8）2min6依据3.3进行操作3.2.2 组织部分3.2.2.1 石蜡包埋组织的处理石蜡包埋组织的前处理可以用四种方法对组织进行前

11、处理。如果使用蛋白激酶K处理，那么核酶的有无、浓度、培养时间和温度等必须根据组织的类型进行优化（1,29,33,36,40,42）不含核酶的蛋白激酶K 源于Roche Applied Science，因为它已经做了核酶有无的检测，否者会导致假阳性。其它溶液可供替代的试剂0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波辐射用。在下表中，描述了不含核酶的蛋白激酶K处理和其它3中替补方法。添加了阴性和阳性对照。根据标准操作对组织进行脱蜡和再水化的操作（如60加热，然后用二甲苯冲洗；用不同比例的乙醇进行系列的再水化过程）（1,33,36）37下，用蛋白激酶工作液培养组织15-30min替代方法处理1. 渗透溶液

12、培养斜面8min2. 胃蛋白酶或胰蛋白酶15-60min，373. 微波放射 斜面置于盛有200ml，pH6.0 ，0.1M的柠檬酸钠缓冲液的塑料瓶中。 350W微波放射5min。PBS清洗斜面两次3.2.2.2 冷冻保存组织的处理所需试剂0.1%的柠檬酸钠溶液（含0.1% Trition X-100），新鲜制备冷冻组织下表描述了冷冻组织的前处理固定和渗透额外的两个样本作为阳性和阴性对照。在15-25下用固定液固定组织20min脱水组织浸泡无水乙醇2min，然后储存在-15-25条件下3.3标识规定3.3.1开始之前Tunel反应混合物的准备取两个管（管1：酶浓缩溶液，管2：标记溶液）为10个

13、样本和2个阴性对照组进行染色，每个样本使用50ul Tunel混合液，每个对照组使用50ul标记溶液。Tunel混合液需在使用前即刻配置，且不可储存。需保存Tunel混合液处于冰冻状态直至使用。具体操作取100ul标记溶液（管2）于对照组。将酶浓缩溶液（管1）的总量（50ul）添加到管2中剩余的450ul标记溶液中，以配成500ul Tunel混合液。混匀，以使各成分充分混合。所需要的其它试剂：微球菌核酸酶或重组脱氧核糖核酸酶，1级*对照：每个试验台上需包括2个阴性对照组及1个阳性对照组。阴性对照温育固定的透化细胞50ul/纯标记溶液替代Tunel混合液阳性对照好用微球菌核酸酶或重组脱氧核糖核

14、酸酶、1级（50mM盐酸中包括3000U/ml-3U/ml，pH7.5，10mM MgCl2 1mg/ml BSA ）在15-25C内1温育固定透化细胞10分钟以诱导DNA断裂，在标记法之前进行。3.3.2有关贴壁细胞、细胞涂片、细胞涂片机的使用和组织的标识规定需要的其他设备及溶液：洗涤液：PBS；湿盒；封口膜或盖玻片。过程：请根据以下表格使用：用PBS溶液冲洗载玻片2次使样本周围区域保持干燥添加50ul Tunel混合液到样本中每个阴性对照组添加50ul 标记溶液。保证Tunel混合液在单层细胞中均匀扩散，避免蒸发造成丢失，温育期间应将样本用封口膜或盖玻片遮盖。加盖，避光在湿盒中37C下温育

15、60分钟。用PBS液冲洗3次。滴一滴PBS液，在该状态下在荧光显微镜下对样本进行分析。使用激发波长范围为450-500nm，检波波长范围为515-565nm（绿色）。3.3.3不同组织的标识规定需要的其它设备及溶液：缓冲液：0.1M，pH6.0；Tris盐酸：0.1M，pH7.5，包括3%BSA和20%正常牛血清；塑料罐；微波；湿盒。请根据以下表格内容进行操作：根据标准步骤进行脱掉固定组织部分的多聚甲醛或福尔马林。把载玻片放到含有200ml 0.1M pH为6.0的缓冲液的塑料罐中。用750W微波照射1分钟。迅速加入80ml蒸馏水（20-25C）进行快速冷却。载玻片转移至PBS液（20-25C

16、）中。不要使用蛋白酶K进行治疗。将载玻片沉于15-25C、0.1M、pH7.5、包括3%BSA和20%正常牛血清的盐酸中30分钟。用PBS液在15-25C温度下冲洗3次。让过多液体流干。在该截面加50ul Tunel混合液。阴性对照组加50ul标记溶液。7避光、潮湿、37C条件下温育60分钟。8用PBS液冲洗3次，每次冲洗间隔5分钟。3.4信号转换洗涤溶液：封口膜或盖玻片；DAB基质或替代POD基质；光学显微镜封固剂。具体操作：请按照以下表格内容进行操作。使样本区域干燥。样本中加50ul POD抗体（管3）。保证POD抗体在单层细胞上均匀扩散，避免蒸发丢失，温育过程中用封口膜或盖玻片遮盖。37

17、C下在湿盒中温育载玻片30分钟。用PBS冲洗3次。加入50-100ul DAB基质或替代POD基质。15-25C下温度载玻片10分钟。置于玻璃下（如：用PBS/甘油），并于光学显微镜下观察分析。替换物：在光学显微镜下进行分析前可对复染样本。4.附录4.1疑难解答该表格描述了各种各样的疑难问题的解答问题试剂或步骤可能的原因解决办法无详尽标注组织嵌入对嵌入物质的聚合进行了紫外线照射（如甲基丙烯酸酯导致DNA分解）使用不同的嵌入物质或不同的聚合试剂。固定酸性固定液（如：石蜡切片、卡诺氏固定剂）试用4%多聚甲醛冲洗液。试用福尔马林或戊二醛。Tunel反应TdT浓度太高可用Tune稀释液稀释到1：2至1

18、：10之间以减少TdT浓度。转换液内在POD活性透化细胞之前在3%H2O2 中浸泡10分钟 以阻止内在活性的POD。非详尽的抗荧光POD链接用正常抗羊血清进行对抗。用含有3%BSA的PBS液20分钟进行对抗。将抗体浓度降至50%。核酸酶一些组织（如平滑肌组织）在准备好组织以后，其DNA 分解会非常快在器官准备好时迅速固定组织肝静脉中灌注固定剂有些酶仍然非常活跃用含有ddUTP及dATP的溶液进行阻止背景颜色过深固定剂福尔马林固定剂导致含有黑色素前体物质的细胞染色为淡黄色试用甲醇作为固定剂，但注意这可能导致敏感性减低。对于乳癌而言，标签混合物浓度过高通过稀释Tunel稀释液*将标签混合液浓度降低

19、50%。样本支原体污染支原体检测试剂盒*细胞高度增生复染，如：用膜联蛋白荧光素*不可能通过酶标仪测量，因为背景颜色太深。标签过低乙醇及甲醇可导致标签过低（在固定期间，核小体与蛋白质无交叉联系，并在染色过程中消失）过度固定导致过量交联蛋白产生减少固定时间试用2%冲洗用多聚甲醛透化作用透化时间太短，导致试剂不能达到目标分子数。增加温育时间在稍高温度下进行温育（如15-25C）试用蛋白酶K、无核酸酶（使浓度和时间尽量适于每种类型的组织）70C下试用0.1M柠檬酸钠30分钟石蜡包埋试剂可达性太低用蛋白酶K、无核酸酶（每种组织要求合适的浓度、时间及温度）脱蜡后处理组织部分在200ml 0.1M pH6.

20、0柠檬酸盐（每种组织最适值不同）冲洗液中试用370W（低）微波照射5分钟阳性对照组中无信号脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶浓度太低冰冻切片用3U/mL 重组DNase I、1级。石蜡包埋组织部分用1500 U/mL 重组DNase I、1级。总之，用1 U/mL 重组DNase I、1级溶解10mM 含有10mM NaCl、5mM MnCl2、0.1mM CaCl2、25mM KCl的pH7.4盐酸，并在37C温度下温育30分钟。替代冲洗液50mM、pH7.5且包含有1mM MgCl2 和1ml BSA。信号弱复染染色欠佳可能需用5%甲基绿在0.1M 、pH4.0的佛罗那醋酸溶液或苏木紫复染。可以用碘化丙啶复染，但仅用于检测细胞形态上的改变。