精选L乳酸高产菌株的选育 doc资料Word下载.docx

1、A 文章编号:1005-9989（200401-0021-03Breeding of L （+-Lactic acid bacteriaXU Zi-jun 1 LI Jian 1 MA Jian-fang 2 WANG Shu-fang 2 LIU Ru-lin 1（1. Life College, Nankai University, Tianjin, 300071; 2. Tianjin Nankai Guard Co.,Ltd, Tianjin, 300071Abstract: Multiple mutagenesis（U.V., NTG, DES were applied and th

2、e L（+-lactic acid producing mutant was selected based on the pathway analysis and metabolic engineering theory. After fermentation for 72 hours, the mutant strain gave a L（+-lactic acid output of 90g/L, 30% higher than the parent strain and sucrose conversion of 88.9%.Key words: lactic acid bacteria

3、; L（+-lactic acid; breeding0 前言乳酸是一种重要的有机酸,可分为D 型和L 型乳酸,人体只能代谢其中的L 型乳酸,而且L-乳酸及其盐类和衍生物在医疗、农业等许多部门都有广泛的用途1。尤其近几年来,人们利用L-乳酸聚合生成的聚L-乳酸制造生物降解塑料,用以解决日益严重的环境污染问题,具有重大意义4-6。然而,从自然界筛选的野生型菌株往往产量不高,达不到生产要求,产量的提高是由多基因作用的结果7。乳酸高产菌应具有以下生化特征:较高的乳酸脱氢酶活性,弱化的丙酮酸脱氢酶系;能耐高浓度的乳酸盐;不具有以乳酸为唯一碳源而生长的能力。本文的育种思路:高浓度乳酸钙平板上挑取菌落,筛

4、选出耐高酸的菌株;利用琥珀酸平板筛选出EMP 途径强化TCA 途径减弱的菌株;在以乳收稿日期:2003-10-08作者简介:徐子钧（1977-, 硕士研究生,研究方向为资源细菌及工程。酸盐为唯一碳源的平板上不长的菌落即筛选出不分解利用乳酸的菌株。最后获得正向突变株。 1 材料与方法 1.1 菌种从自然界筛选到的Lactobacillus sp. S 3,已证实其产物为光学纯度95%以上的L（+-乳酸,发酵产率为68g/L 。 1.2 培养基MRS 培养基7;高乳酸钙平板:MRS 培养基加入一定浓度的乳酸钙;乳酸平板:用1%的乳酸代替MRS 培养基中的葡萄糖成分;琥珀酸平板:用3%琥珀酸代替MR

5、S 培养基中的葡萄糖,其他成分不变。 1.3 复合诱变方法22 食品技术率70%80%的时间,加入到新鲜种子培养液中,避光条件下培养24 h 。1.4 高产菌株的筛选 2 结果与讨论2.1 紫外线处理对S 3菌株存活的影响紫外线处理后,结果如图1所示。紫外诱变处理56 min ,致死率为70%80%。2.2 NTG 处理对S 3菌株存活的影响经紫外诱变后的S 3菌株再经NTG 处理后其致死曲线见表1。经过NTG 诱变处理30 min 后,致死率为83.3%。表1 NTG 对S 3菌株存活率的影响作用时间（min0 30 60 748 40 2 致死率（%在高浓度乳酸钙平板上筛选到的菌株M 23

6、与S 3相比,其产量提高了20%（图2。2.3 DES 处理对M 23菌株存活的影响紫外线、NTG 处理后筛选到的菌株M 23再经DES 处理,其致死曲线见图3。经过DES 处理后,M 23菌株致死率70%80%时的致死剂量为5 min 。2.4 菌种选育结果出发菌株经过5min 紫外线照射后,避光培养过夜,再经过NTG 、DES 复合诱变,在11%的高浓度乳酸钙平板上选出50株菌,用琥珀酸平板和乳酸平板筛选,并进行产量测定,经复筛选出M 7菌株。在相同的条件下,M 7和出发菌株S 3发酵情况见表2。经过复合诱变处理后,菌株S 3和M 7分别产乳酸69g/L 和90g/L ,经复合诱变后的菌株

7、M 7比原菌株S 3产量提高30%。表2 诱变处理对Lactobacillus S 3产酸的影响 时间（h0 24 48 72 残糖（g/L 120 57 38.5 20 S 3 乳酸（g/L 0 31 42 69 残糖（g/L 120 68 19 0 M 7乳酸（g/L4972902.5 诱变菌株的遗传稳定性经传代10代后,M 7菌株产酸仍可达到原水平,可见M 7菌株有较强的遗传稳定性。 3 小结3.1 经过复合诱变处理,得到了高产L（+-乳酸的23菌株。在相同的条件下,经多次实验考察,M 7和出发菌株S 3分别产乳酸86g/L 和66g/L ,产量提高30%。3.2 根据代谢调控理论,挑选

8、在高浓度乳酸钙的平板、琥珀酸平板上比出发菌株生长滞后,并在乳酸平板上不生长的菌株来筛选高产乳酸菌株,大大减小了工作量。参考文献:1 曹本昌,等.L-乳酸研究综述.食品与发酵工业,1993,（3:56-602 Severson,et al.Lactobacillus delbrueckii spp. Bulgaricusstrain and fermentation process for producing L（+-lactic acid.United States Patent: 5416020,1995 3 Ali Demirci,et.al. Enhanced production of

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10、高压就是对肌肉系统加一次压,短时间停顿后再释放一次压力,这样重复几次,此过程中并不需要把样品从压力容器中移开。系统的温度在每个阶段并不完全相同,这主要依赖于处理条件,所以高压处理发生在变化的温度和压力状况下（表4,振动加压看起来对抑制微生物比对引起肌肉组织的变化或影响凝胶结构性质更有效（Carballo et al ,2001。表4 振动或逐步脉冲的高压处理 样品 条件肉糊400MPa/216, 48min/701 Cheftel J C,Culioli J.Effect of high pressure on meat:Areview.Meat Science,1997,46（3:211-2

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13、h-fat meat batters as affected by high hydrostatic pressure.Journal of Agriculture and Food Chemistry,1996,44（7:1624-1625 6 Suzuki T,Macfarlane J J.Modification of the heat-settingcharacteristics of myosin by pressure treatment.Meat Science,1984,11（4:263-2747 Ikeuchi Y,Tanji H,Kim K,Suzuki A.Dynamic

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