牛血清白蛋白荧光猝灭法测定药物中的头孢丙烯Word格式文档下载.docx

1、荧光猝灭；牛血清白蛋白Determination of Cefprozil in drug by Bovine Serum Albumin Fluorescence Quenching MethodAbstract : To investigate a new method to detect the Cefprozil in drug by fluorescence quenching of bovine serum albumin. The Bovine serum albumin （BSA） has a strong intrinsic fluorescence because of t

2、ryptophan and tyrosine. The fluorescence intensity of BSA decreased when the Cefprozil combination with the BSA. In a certain range, the fluorescence quenching of BSA in the ex = 340 nm has a good linear relationship with the concentration of Cefprozil. The new method to detect the Cefprozil in drug

3、 was established. Results The conjugate of BSA and Cefprozil had a max fluorescence value at 342 nm which was found the decreased intensity of fluorescence at 342nm was proportion to Cefprozil in the range of 2.37L-1molL-1 .The linear regression equation wasF=2.0107Ccp+18.905 with a correlation coef

4、ficient of 0.9958. The detection limit was 2.8496L-1 . The relative standard deviation was 0.43% and the average recovery of sample was 92.4%-109.4%. The method was simple and rapid. It can be applied to detect the trace Cefprozil in drug with satisfactory results.Key words：Cefprozil; Fluorescence Q

5、uenching; bovine Serum Albumin; Mechanis目 录1 引言 11.1 研究的目的和意义 11.2 国内外相关的研究现状 21.3 荧光猝灭法简介 22 实验部分 32.1主要仪器 32.2 主要试剂 32.3 试验方法 33 结果与讨论 33.1 荧光光谱 43.2 适宜的反应条件 53.2.1 缓冲溶液的选择 53.2.2 pH值的影响 53.2.3 缓冲溶液用量对荧光强度的影响 63.2.4 BSA浓度的影响 63.2.5 试剂加入顺序的影响 73.2.6 反应时间对荧光强度稳定性的影响 93.3 方法的选择性与分析应用 93.3.1 方法的选择性 93

6、.3.2 标准曲线、检出限及精密度 103.3.3 片剂中孢丙烯片的含量测定 104 结论 115 展望 11致 谢 131 引言1.1 研究的目的和意义血清白蛋白是人和动物体内血浆中含量最丰富的蛋白质，它不仅是维持血浆渗透压的主要力量，也可以与许多内源性或者外源性物质（如金属离子、脂肪酸、氨基酸、代谢物、胆红素、酶、药物和激素等）的存储和转运，是一种含有多个配位基因的生物大分子。药物进入人体后，首先要通过血浆的贮存和运输，到达受体部位并发生药理作用，多数有机药物在血浆中都或多或少地与血清白蛋白结合，然后再被运送到身体的各个部位，最终发挥其药效作用。另外，药物与血清白蛋白结合后，药物不易穿透毛

7、细血管壁，限制其进一步运输，这对药物在体内的代谢和分布产生了重要影响。当药物与血清白蛋白结合后，使药物存留在血浆中，以此减弱了药物的最大作用强度，防止作用大幅度波动以及延长药物的作用时间1-2。因此药物与血清白蛋白的结合时是药物的暂储形式，是控制药物向受体释放、避免药物迅速代谢的主要途径。牛血清白蛋白（ bovine serum albumin，BSA）是结构剖析比较成熟的蛋白质3-4，是生命科学、化学、医学等学科研究蛋白质与小分子的相互作用的对象。头孢丙烯（Cefprozil，简称CE，结构式见图1）属第二代高效、低毒、耐酶口服头孢菌素类抗生素，活性成分由头孢丙烯顺式和反式2种异构体组成,其

8、抗菌活性略高于头孢氨苄、头孢拉定,与头孢克洛、头孢呋辛相近。临床用于敏感菌所致的轻、中度感染,包括上、下呼吸道感染,以及皮肤和皮肤软组织感染 5。分子光谱法研究药物小分子与生物大分子的相互作用已有报道6-8 ，但 CE与BSA 相互作用的研究尚未见报道。而且对它的测定方法较少，主要有高效液相色谱法（HPLC）9-12。 但这些方法使用的仪器价昂， 运行成本高，而且操作较繁琐，不利于日常分析中的推广应用。因此进一步发展高灵敏、简便快速的分析方法是一项有意义的研究工作。图1 头孢丙烯结构式Figure 1 The Structural formula of Cefprozil 1.2 国内外相关的

9、研究现状早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时，这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之消失。直到1852年才由斯托克斯（Stokes）给予了解释，即她是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。斯托克斯再对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。1867年Goppelesroder应用铝-桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。进入20世纪，随着荧光分析仪的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。用荧光猝灭法研究有关药物与血清白蛋白的研究在国内外都比较多见，可见此方面的研

10、究已经比较成熟，本文用牛血清白蛋白作光谱探针，研究了头孢丙烯对BSA荧光光谱的影响、适宜的反应条件、影响因素及其分析化学性质，并以BSA 作探针用荧光猝灭法测定了药物中头孢丙烯的含量，为了解头孢丙烯与蛋白质的相互作用提供了信息，也为发展以生物大分子作为荧光探针测定头孢丙烯的新方法创造了条件，该方法目前尚未见文献报道。1.3 荧光猝灭法简介荧光猝灭指的是荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致的荧光强度下降的物理或化学作过程。与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质，称为荧光猝灭剂。猝灭过程实际上是与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态的过程。荧光猝灭作用在荧光分析中有降低待

11、测物质的荧光强度的不良作用的一面，但另一方面，人们也可以利用某种物质对荧光物质的荧光猝灭作用而建立对该猝灭剂的荧光测定方法，一般来说，荧光猝灭法比直接荧光测定法更为灵敏，并具有更高的选择性。此外，粗灭效应的研究还可以用以解释猝灭剂的空散速率等。荧光分析法最大的优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2到4个数量级；选择性也比分光光度法好。虽然能产生强荧光的物质相对较少，荧光分析法的应用也不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质，使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究等各个领域具有重要的意义。2 实验部分2.1 主要仪器 F-46

12、00荧光分光光度计（日本日立公司），测定参数：狭缝宽度 10.0 nm，光电倍增管（PMT） 负高压为 400 V；Cary 50型紫外可见分光光度计（美国瓦里安技术中国有限公司），pHS-3C精密酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司）；DHG-9035A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；恒温水浴。2.2 主要试剂牛血清白蛋白（BSA，分子量为68000，纯度大于等于98%，上海楷样生物技术有限公司）：准确称取BSA 0.6800g于100mL容量瓶中稀释至刻度，配制成浓度为1.010-4mol/L的储备液保存在04 的冰箱中；头孢丙烯（Cefproprozil,分子量=389.042

13、56，纯度=84.9%，中国药品生物制品检定所）：准确称取头孢丙烯0.0390g于100mL容量瓶中配制成浓度为1.000110-4mol/L的储备液；0.5mol/LNaCl溶液：用以维持生理条件下的离子强度；0.4mol/L的Tris溶液（分子量=121.14，纯度99.5%，进口分装，广州市化学试剂玻璃仪器批发部）：称取Tris 4.8468g于100mL容量瓶中加水稀释至刻度；PH=7.4的Tris-Hcl缓冲溶液：分别取0.4mol/L的Tris溶液50mL、0.4mol/L的Hcl 43mL于100mL容量瓶中稀释至刻度制得。其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。2.3 试验方

14、法于10.0mL比色管中依次加入0.2mol/L，pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液2mL；0.5mol/LNaCl溶液2.0mL以保持反应体系的离子强度；1.010-5mol/L的BSA 1.0mL和不同体积的0.94910-5mol/L的头孢丙烯溶液， 用水稀释至刻度并摇匀, 放置 60 min。用荧光分光光度计记录荧光光谱, 其最大激发和发射波长（ex/em）位于 280 nm/342 nm 处，于 1 cm 石英池中分别测量反应体系的荧光强度 F 及试剂空白的荧光强度 F0，得出猝灭强F；FF0-F。3 结果与讨论3.1 荧光光谱在实验条件下，头孢丙烯本身没有荧光，而BSA分子中的

15、酪氨酸、色氨酸等氨基酸残基能够产生荧光，因而BSA是内源性荧光物质13, 并在ex/em280/342nm 处。当BSA与头孢丙烯反应形成结合产物时，虽然最大激发和发射波长均未发生变化， 但是其荧光强度明显降低（图2）。由图 2 可以看出，在保持BSA浓度不变的情况下，BSA的内源性荧光强度在一定范围内与Cp的浓度成正比，说明头孢丙烯与BSA之间发生了相互作用。图2 头孢丙烯与BSA的荧光光谱Figure 2 Fluorescence spectra of Cefprozil and BSA112. C BSA= 1.010-5mol/L,Ccp=0.94910-5mol/L,Vcp/mL:

16、from 1 to 12：0、 0.25、0.5、0.75、1.00、 1.25、 1.50、1.75、2.0、2.25、2.5、3.0mL; pH=7.43.2 适宜的反应条件3.2.1 缓冲溶液的选择缓冲溶液的影响 考察了K2HPO4-KH2PO4、K2HPO4-柠檬酸、Tris-HCl及KH2PO4-NaOH缓冲溶液对反应体系荧光猝灭的影响。结果表明，使用Tris-HCl缓冲溶液时效果最好，荧光猝灭程度F最大，见图3。因此；实验选择Tris-HCl缓冲溶液调节酸度。图3 缓冲溶液的影响Figure 3 Effect of buffer solutionC BSA= 1.010-5mol/

17、L,3.2.2 pH值的影响 分别考察了pH为7.10、7.30、7.40、7.50、7.70、8.00、8.20、8.50、8.70、8.90时Tris-HCl缓冲溶液对体系的影响；结果如图4所示，表明适宜的酸度范围pH 7.308.50，在此范围内，体系的F达到最大且保持恒定。当低于或高于此pH范围时，均导致F值的降低。在正常生理状态下，动物细胞完成生理功能的最佳pH保持在7.357.45之间，因此，本实验选择pH为7.40的Tris-HCl缓冲溶液作为反应的缓冲溶液。因为pH为7.40的Tris-HCl缓冲溶液接近生物的生理PH。图4 缓冲溶液的pH对荧光强度的影响Figure 4 bu

18、ffer solution of pH on the fluorescence intensity influence3.2.3 缓冲溶液用量对荧光强度的影响 分别考察Tris-HCl缓冲溶液的用量为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL时对反应体系的影响。结果如图5所示，当Tris-HCl缓冲溶液的用量在2.03.0 mL范围内时，F基本保持稳定达到且最大。因此实验选用pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液2.0 mL。3.2.4 BSA浓度的影响固定其它实验条件，改变BSA的浓度，测定BSA溶液分别为：5.010-63.010-5mol/L时对体系的荧光强度的影响（见图

19、6）。实验表明， BSA浓度在0.510-61.510-5范围内时，F随BSA浓度的增加而增强；当BSA浓度在1.510-53.010-5mol/L范围内时，F基本保持稳定且最大。因此实验选用2.010-5 mol/LBSA作为探针浓度。图5 缓冲溶液的用量对荧光强度的影响Figure 5 Effects of the buffer solution on the fluorecence intensity 3.2.5 试剂加入顺序的影响试剂加入顺序对体系的荧光强度影响较大。分别研究了以下四种试剂加入顺序：1、Tris-HCl NaClBSACP 2、Tris-HCl NaClCPBSA 3、

20、BSACPTris-HCl NaCl 4、CP BSATris-HCl NaCl结果见图7，当顺序为BSACPTris-HCl NaC，猝灭强度F=F0/F最强考虑体系荧光强度的增强程度及稳定性等因素，实验选择3的加入顺序。3.2.6 反应时间对荧光强度稳定性的影响考察了3h内时间对反应体系的影响，结果见图8。实验结果表明，头孢丙烯与BSA图6 BSA浓度的影响Figure6 Effect of concentrations of BSA on the fluorecence intensityCcp=1.032710-5mol/L图7 试剂加入顺序对荧光强度的影响Figure7 Effect

21、 of Addition sequence of reagents on the flurescence intensity的相互作用在室温下需要 60 min 左右完成, 此后 F 值可在 3h 内稳定，荧光强度具有很好的稳定性，以下实验均在60 min后进行荧光测量。图8 反应时间的影响Figure 8 Effect of reaction time on the flurescence intensity3.3 方法的选择性与分析应用3.3.1 方法的选择性实验了常见金属离子、氨基酸和糖类等共存物质对头孢丙烯的影响，结果列于表1中。从表1中可以看出，当相对误差5.0%，头孢丙烯浓度为1.

22、032710-5时， K+、NH4+、Na+、Zn2+、Ba2+、NO3-、Cl-、SO42- 、糖类、尿素和大多数氨基酸等几乎不影响头孢丙烯的测定， 但是 Fe3和Cu2等对体系的干扰较大，在测定中可选择分别加入EDTA 和硫脲将其掩蔽。因此，通过以下十多种试剂的实验，此方法具有良好的选择性，可用于痕量头孢丙烯的测定。表1 共存物质的影响（Ccp =1.032710-5mol/L）Table 1 Effects of coexisting substances （Ccp=1.0327Coexisting substance共存物质Time倍数Relative error（%）相对标准偏差KC

23、l1000-3.74MnCl293.88NH4Cl3.12CrCl3KH2PO46002.49L-Arginine100-4.4BaCl2-1.81Glycin4.0CuSO423.43L-Phenylalanine2.5ZnSO480-2.93Maltose7503.5AlCl330-4.29Glucose40FeCl362.35Lactose2004.6Pb（NO3）2-4.05Urea-2.7Ni（NO3）270-3.68Uric acid3.7Cd（NO3）24.29VB610-4.1NaNO32400-3.753.3.2 标准曲线、检出限及精密度在最佳实验条件下绘制标准曲线，结果表明

24、F与头孢丙烯浓度在2.37L-1范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为F=2.0107Ccp+18.905，相关系数r=0.9973，检出限（3）为2.8496L-1。对浓度为0.949L-1的头孢丙烯进行15次平行测定，方法的相对标准偏差为0.43%。3.3.3 片剂中孢丙烯片的含量测定随即取10片头孢丙烯片（250mg/片），称重后研磨均匀，准确称取样品0.595g，用少量乙醇溶解，置于 100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，经过滤，弃去初滤液后，取10 mL滤液转移至100mL容量瓶中，用水定容，摇匀，备用。分别量取0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5m

25、L样品溶液于10mL比色管中，按实验方法测定头孢丙烯的含量，并用标准加入法检验方法的回收率，结果列于表2。表2 片剂中头孢丙烯含量的测定结果Table 2 Results for the determination of Cefprozil in tabletsSample样品Average found平均测量值g/pieceAdded标准加入量Total found回收值Recovery回收率（%）RSD10.24760.20780.477295.420.570.24650.491592.420.3730.24870.4563100.060.4440.4194108.850.5350.245

26、70.468696.770.410.24860.4171109.440.197 0.24830.483994.240.2380.24640.4486101.250.174 结论 在模拟生理条件下，头孢丙烯对BSA 的内源荧光有明显的猝灭作用，最大猝灭波长位于 340 nm左右。当头孢丙烯的浓度在2.37L-1 范围内时, 体系的荧光猝灭值（F）与头孢丙烯的浓度成正比。据此提出了一种以蛋白质为荧光探针测定痕量头孢丙烯的新方法。本法简单、快速、选择性好、灵敏度高，可用于片剂中头孢丙烯的测定，具有良好的应用前景。5 展望药物分子与蛋白质作用机理的研究与应用是医学、药理学、化学、分子生物学、生命科学中

27、的重要课题。近年来，药物分子与生物大分子之间相互作用的基础研究已逐渐成为国内外学界、业界关注的热点，开展这方面的研究工作是化学学科未来发展的趋势之所在。荧光光谱法作为研究溶液中蛋白质分子构象的一种有效方法，能够提供药物与蛋白质相互作用时药物在生物体内的吸收、分布、排泄、代谢、转化的信息。为了能更系统化深入的研究，我们力求得到更完整的荧光光谱数据，以达到建立指纹荧光图谱的目的。对用光谱法未显示出相互作用的药物蛋白质体系，建立新的研究方法来探求它们相互作用的机理与模式。由于蛋白质构象的复杂性，应该综合运用多种实验方法研究同一课题，利用方法之间的互补，相互进行比较、对照，以获得更多、更可靠的信息。未来的趋势必将是探索荧光分析新方法，与计算机技术紧密结合，研制出自动化程度高，获得和处理信息速度快的荧光分析仪器以充分发挥药物荧光分析灵敏度高、选择性好及可提供光谱信息多、简便易行的优点，同时借助计算机技术，进一步完善分子模拟效果，深化药物分子对蛋白质活性部位结合特征的探讨，并与实验结果作比较，从而得到药物分子与蛋白质相互作用的最可靠信息。参考文献1 王克夷. 蛋白质导论M. 北京: 科学出版社, 2007, 12.2 申泮文, 徐辉碧, 庞代文. 化学生物学与生物技术M. 北京: 科学出版社, 2005, 191192.3 Yan. L-F. Sun.Z-R.