细菌鉴定流程Word格式.docx

1、 边缘注意事项：1 接种划线应在酒精灯旁边操作2 培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色1.涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2.染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。（2）加上碘液染色1分钟，水洗。（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约2060秒，水洗，吸去水分。（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。（5）吸干或在空

2、气中晾干后，油镜镜检。3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。 标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。 玻片通过火焰温度不能太高。 碘液变透明，则不能使用。 水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。三、16S rDNA 鉴定（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。4. 沸水浴10min，1200

3、0rmp离心2min，取1.5ul上清作为模板，上下游引物各0.5ul加到23ul体系中，每个样品做3个平行，进行PCR扩增。 使用离心机时一定要配平，防止损坏离心机。 实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。（若结果不理想则用改良方法）1收集菌体，或直接从平板上刮取细菌（直径约1.5-2mm左右大小菌落的菌量），加入含20ul 0.1-0.5% Triton X-100的200ul PCR管中，充分重悬。2对于较难散开的细菌则可采用500ul体积（同样含0.1-0.5%Triton X-100），使用超声重悬（菌体相应增加），处理后取出20ul加入200ul PCR管中。3. 将上述PCR

4、管置于沸水中水浴处理5分钟，短暂离心（约30s）后，取1ul作为模板加入20ul（或25ul）体系中，进行PCR扩增。0.1-0.5% Triton X-100的配置： 30%储备液的配置 Triton X-100 1.41ml 0.1mol/L PBS（pH=7.3） 3.64ml 充分混合后，置3740水浴中23h，使其充分溶解混匀，备用。 用前取该储备液稀释至所需浓度，取1-5ul储备液加入300ul双蒸水中。 普通PCR体系：（23ul反应体系） 50管PCR体系配制ddH2O 918.5ul10buffer 125uldNTP 100ulrTaq 6.5ul1.配制体系所用的200l

5、 PCR管、1.5ml离心管、纯水、1ml枪头、200l枪头、10l枪头均需灭菌，且在无菌操作台中操作。2.配制体系前先将50个200l的PCR管放在冰盒上预冷。3.取一个无菌的1.5ml离心管，依次将药品加入管中，在漩涡混合器上混合510秒。4.每23l分装入200l PCR管中，放-20备用。5.使用体系之前先验证体系是否好用。例如：取实验室已知菌加16s上下游引物进行PCR反应，电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。（1）10buffer、dNTP、rTaq用完尽快放回-20保存。（2）无菌操作PCR程序： 94 5min 94 30s35个循环 55 30s 72 1 min 30s

6、72 10 min 4 1 minPCR产物进行 1.0% 琼脂糖凝胶电泳1.先安装配胶槽，再将梳子插到槽中2.缓冲液的配制：（1）50 TAE Buffer储备液Tirs 12.1g 、Na2EDTA.2H2O 1.86g ，加30ml去离子水搅拌溶解，加醋酸2.855ml充分混匀，去离子水定容至50ml。（2）1 TAE Buffer取10ml 50 TAE Buffer储备液 加490ml的纯水，摇匀，待用。3.配胶：琼脂糖 0.15g缓冲液（1TAE） 15ml加热煮沸3次待温度降低到5060时加入1滴核酸染液（GoldView）摇匀倒入槽内待胶凝固约30min。4.拔出梳子，将凝胶放

7、入水平电泳槽中，保证缓冲液没过梳孔。5.上样：（1）取3ul 标准 DNA Maker点入左边第一个梳孔，从左到右顺序点样。（2）取一只塑料手套，将1ul 6Loading buffer点到手套上（3）取3ul PCR产物与1ul 6Loading buffer即3:1混匀点入梳孔。6盖上电泳槽盖子，恒压120V电泳，至溴酚蓝跑到胶的1/3处停止电泳（约20min），用凝胶成像系统进行采集观察，其浓度与DNA Maker比较，即亮度和长度。7. 如果与预测结果相同时，填写送出测序的单子，并联系北京华大基因有限公司，同时将至少40l PCR产物放4保存待测序公司来取样。8.PCR产物送进行测序。

8、*注意事项：核酸染液属于致癌物质，配胶以及与胶有关的仪器一定要戴胶皮手套操作测序结果分析：将测序结果掐头去尾后在NCBI（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站上进行BLAST比对。具体操作步骤如下：可参照相似度95%以上为可信结果。结合细菌形态学鉴定、革兰氏染色、16S rDNA比对结果初步判定该菌是属于哪个属，进行以下实验。四、生理生化鉴定选用API相关菌属鉴定试剂盒，具体类型参照以下：（1）API 20 E鉴定革兰氏阴性杆菌（2）API Listeria 鉴定李斯特菌（3）API 20 NE 鉴定非肠道革兰氏阴性杆菌（4）API 20 C AUX 鉴定酵母菌（5）A

9、PI 20 A鉴定厌氧菌（6）API Coryne 鉴定棒状杆菌（7）API 50 CHB 鉴定芽孢杆菌（8）API Campy 鉴定弯曲菌（9）API Staph 鉴定葡萄球菌和微球菌（10）API Strep 鉴定链球菌（11）API 50 CHL鉴定乳酸杆菌（12）API NH 鉴定奈瑟氏菌、嗜血杆菌、布兰汉球菌检测方法：（具体参考说明书）1.试剂条的准备：准备培养盒（盘和盖子），向盘的蜂窝状孔中倒入约5ml蒸馏水或去离子水，创一种潮湿的环境。将菌株参考号记录在托盘的长条上，从各个包装中取出试剂条，将试剂条放入培养盒中。2. 接种物的准备：用0.9%的生理盐水将培养板上的菌冲下收集（建议

10、使用早期培养物1824h），该菌悬液制备好后必须立即使用。3. 试剂条的接种：将菌悬液接种到微型管中，只填充试管部分，杯型器不填充（微型管留少许不充满）。将试剂条稍前倾，将吸管或滴管的顶部靠在杯的侧面，以免管的底部形成气泡。4. 用矿物油填充杯形器，形成凸出弯月面，以保证ADH和URE实验的无氧环境。5. 在36下培养1824h。五、药敏实验1.将平板上纯化出的菌用23ml 0.9%灭菌生理盐水冲下，制成菌悬液。2.无菌条件下取100l菌悬液到培养基平板上。根据培养基的干湿程度适当调整菌悬液的用量。3.三角玻璃刀蘸酒精后，经过酒精灯高温灭菌，待火灭后温度降低至20左右，均匀涂布4.将药敏纸片贴

11、到平板上，每个平板上可贴4个药敏纸片，常用水产药物：诺氟沙星（氟哌酸）、头孢曲松（菌必治）、庆大霉素、奥复星（氧氟沙星）、头孢哌酮、强力霉素、四环素、卡那霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素、吡哌酸、先锋霉素、氨苄西林、青霉素、利福平、多粘菌素、磺胺甲基异恶唑5.28恒温培养24h后测量抑菌圈直径大小。1贴药敏纸片时字朝里 2正置培养 配制培养基NA固体培养基（1） 称取蛋白胨3.3g放入三角锥形瓶中。（海水培养基加NaCl至终浓度为20）（2） 蒸馏水定容至100ml，并放入转子，用锡箔纸封口，记号笔标注时间名称。（3） 将三角锥形瓶放在磁力搅拌器上高温搅拌，待液体透明并大量气泡产生时迅速拿下（戴手套，防止烫伤），用吸铁吸出转子。（4） 将三角锥形瓶、装有平板的铁桶放入高压灭菌锅中，121 灭菌15分钟。（5） 将灭好的培养基及铁桶迅速放到操作台中，紫外通风，待培养基温度不烫手时倒板（在酒精灯旁操作）。（6） 打开平板盖子，紫外线通风约30min，待凝固后盖上盖子，平板放4保存。 操作台使用前喷酒精，用无菌棉擦干，紫外通风约30min。 放入灭菌锅前装有平板的铁桶的排气孔处于打开状态，灭菌完应迅速关闭排气孔后放入操作台中。