双向电泳使用说明Word文档格式.docx

1、本手册对使用从Amersham Pharmacia Biotech公司购得的预制IPG胶条进行双向电泳的方法进行了描述。双向电泳的开始步骤是样品预处理。适当的样品预处理方法对得到好的双向电泳结果相当重要。双向电泳下一个步骤是IPG胶条的重新水化。购得的IPG胶条是干的，在等点聚焦（IEF）之前必须将IPG胶条在含有合适的试剂的溶液中进行水化。第一向等点聚焦是在有温度控制及高电压的条件下的平板电泳仪上进行的。接下来，为了进行第二向的分离，IPG胶条在含有SDS的缓冲液中进行平衡。平衡后，将IPG胶条放在第二向凝胶上进行电泳。最后的步骤是进行显影及对双向电泳点阵结果进行分析。表1.双向电泳的仪器选

2、择第一向等点聚焦（IEF）的仪器选择MultiphorTMII 电泳仪及ImmobilineTM 干胶设备在膨化托盘中进行重新水化使用固相干胶设备在MultiphorTMII电泳仪进行等点聚焦选择因素：MultiphorTMII 电泳仪既可以进行第一向也可以进行第二向分离。MultiphorTMII 电泳仪是多功能的，对利用IPG胶条进行等电聚焦没有限制。其它的电泳技术也可以在这台仪器上进行。图1.MultiphorTMII 电泳仪及ImmobilineTM 干胶设备 IPGphorTM等点聚焦系统重新水化和等电聚焦同时能在IPGphor胶条支撑槽中进行 选择因素在没有人看管条件下，重新水化过

3、程和等点聚焦可以在晚上进行。对IPG胶条的操作很少，减少了错误的机会。由于电泳时电压很高，因此分离速度和效果很好。电源的供应和温度控制都组建在设备内。图2. IPGphorTM等点聚焦系统 表1.第二向SDSPAGE电泳设备的选择 Multiphor II（平板系统）24.511cm或24.518cm凝胶提供了预制的凝胶：ExcelGelTM8-18%（24.511cm）,ExcelGelXL（24.518cm） 相当快的速度：电泳时间小于4小时。 分辨率高。 可以使用所有类型的IPG胶条。图3. Multiphor II（平板系统） HoeferTM miniVE或SE260（mini ve

4、rtical）89cm凝胶 选择因素 电泳速度非常快：12小时 用7cm IPG胶条进行电泳效果最好。图4. HoeferTM miniVE HoferTM SE600 （标准垂直型）14（或16）15cm凝胶 电泳时间45小时。 分离的效果中等（15cm长的凝胶）。 能容纳胶的数量中等。（最多达4块胶）。 用13cm的IPG胶条进行电泳效果最好。 图5. Hoefer SE 600 HoferTM DALT（大型垂直型） 2419cm 凝胶 电泳需要7小时，一般可在晚上进行。 分辨率极高（19cm长的凝胶）。 蛋白质加样量大。 能容纳胶的数量大。（能同时进行10块胶电泳） 图6. Hoefe

5、r DALT概括起来，双向电泳的实验步骤为:1样品的预处理2 IPG胶条的重新水化 3 等电聚焦电泳（IEF）4 IPG胶条平衡5 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）6 显影7 结果分析1.2 设备的选取根据电泳方法和等电聚焦（IEF）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）装置可以选择不同的设备。表1列出了可以从Amersham Pharmacia Biotech公司购得的设备。如果想要各种设备操作的详细资料，请参考各设备的使用手册。等电聚焦设备的选择Amersham Pharmacia Biotech提供了进行第一向电泳的两套不同的仪器：Multi-phorTM仪

6、器及附件、IPGphorTM等电聚焦设备。Multi-phor是一台多功能仪器，它能用来进行一些不同的电泳技术。对于双向电泳，它既能进行第一向电泳（IEF），也能进行第二向（SDS-PAGE）电泳。胶条的重新水化可以在固相干胶条再膨化盘（Immobiline Dry Strip Reswilling）内进行。重新水化后，IPG胶条被转移导电泳仪上进行第一向等电聚焦（IEF）。该电泳设备是由Multiphor平板装置和固向干胶条配套器件（Immobiline Dry Strip Kit ）组成（图1）。这个设备能进行最多达十二条水化后的同样长度的IPG胶条进行任何规格的等电聚焦（IEF）。电源由

7、EPS 350XL电源供应仪提供，MultiTempTM静热循环仪（Thermostatic Circulator）控制电泳时的温度。在IPGphor等电聚焦设备在IPG胶条上等电聚焦进行第一向的分离相当简单。IPGhor等电聚焦设备是由支撑槽和IPGphor部件组成，IPGphor的支撑槽既能用来进行IPG胶条重新水化又能用来进行等电聚焦（IEF），IPGphor部件能提供8000V的电压，并在内部安装了温度控制器。编程化的参量可以用来控制重新水化及其间的温度。等电聚焦的温度及最大电流，并且还可以控制在进行一次分离过程中各步骤及过程中电压的方式。多达12个同长度胶条支撑槽可以放在IPGpho

8、r平台进行任何一种规格的等电聚焦。由于胶条重新水化和等电聚焦（IEF）能不在使用者干预下连续进行，因此，它能在无人看管下过夜进行。其中一些对IPG胶条的操作能产生很少故障，如：胶条混淆、污染、空气接触及尿素的结晶，由于可以利用高电压，因此，分离速度非常快。表2列出了利用Multiphor设备和IPGphor等电聚焦设备在第一向电泳中的主要区别。表2. 等电聚焦设备选择最大电压需要的附件设备等电聚焦的时间（IEF）Multiphor3500V固相干胶膨化盘固定干胶配套器件（Figure 1）EPS350XL电源供应仪MultiTemp静热循环仪348小时IPGphor8000VIPG胶条支撑槽1

9、.5-24小时最佳的聚焦时间依赖于IPG胶条的长度及pH值的范围和样品的特性，进行相同的分离，IPGphor设备比Multiphor设备快2倍。出于安全原因，很高电压的是不可取的。第二向电泳的设备选择第二向电泳分离既可以在平板设备上进行也能在垂直设备上进行。表3提供了合适于第二向电泳的设备及胶的大小和于之相匹配的IPG胶条的长度，进一步的考虑因素在下面将讨论。表3.第二向电泳设备选择凝胶的近似大小（长宽cm）凝胶数量凝胶厚度（mm）IPG胶条长度（cm）总的电泳时间（h:min）平板型MultiphorII ExcelGel111810.5全部1:453:20垂直式Hoefer miniVE或

10、SE260921,1.5730Hoefer SE600141516152或411,135:00Hoefer DALT2419107:0015:1 在一片ExcelGel凝胶上，同时使用较短的胶条：两条11cm胶条或3条7cm胶条2 若 使用1CM 宽度的空间3 利用附加的分隔板，能容纳四块凝胶MultiphorII平板型设备利用这种设备在大尺寸的凝胶上进行电泳能产生很好的分辨率，并且分离的速度相当快。预制的ExcelGel凝胶产品为随时可用的凝胶和缓冲胶条提供了方便性。MultiphorII（figure3）设备使用起来很方便，它是多功能的，同时可以进行第一向等电聚焦（IEF）和第二向十二烷基

11、磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。IPG 胶条中带有的蛋白质量能超出薄且水平的第二向电泳中的凝胶。因此在进行微量预备分离中，往往利用较厚垂直的第二向凝胶。若在进行第一向电泳中，使用PH值范围为611的IPG胶条，一般不建议使用MultiphorII设备进行第二向电泳。垂直型的设备垂直型的设备使用起来相当方便，并且能同时进行多块胶的分离。垂直型的第二向凝胶既可以是1.5mm厚度又可以是1.0mm厚度。为了迅速起见，建议使用微型凝胶（MiniGel）电泳仪器Hoefer miniVE（图4）或SE260。这样，第二向电泳分离一般在12小时内能完成。如果要快速取得粗略的蛋白质情况或当样品中

12、只有几种不同蛋白时，使用微型凝胶（MINIGEL）进行第二向电泳是可取的。为了提高分离的分辨率和效果，建议使用标准规格的Hoefer SE600垂直型电泳设备。Hoefer SE260同时能容纳4块16cm长的凝胶。当与静热循环仪如MultiTEMPIII一起使用，内建的热量转换装置能起到降温作用，从而能提高分离的重复性。使用14cm宽度的凝胶，标准的垫片宽度为2cm。如果想利用在13cm IPG胶条两端的用来进行分子量标记的额外空间，使用1cm宽的垫片能进行16cm宽的凝胶的电泳。为了得到最好的分辨率、重复性和提高样品容量，建议使用Hoefer DALT设备的大型凝胶类型。Hoefer DA

13、LT设备能容纳所有梯度的18cm的IPG胶条（加上分子量标记），并且最多能达10块凝胶同时跑电泳。一个内置的热量交换器和缓冲液循环泵能提供稳定的温度环境和对温度精确的控制。在Hoefer DALTMultip胶模中能同时浇注20或更多块的11.5mm厚的凝胶。1.3实验室技术 在处理IPG胶条、SDS聚丙烯酰胺凝胶、ExcelGel缓冲胶条以及任何要接触的仪器时，请戴上手套。使用手套能减少杂点和条带的污染。 将所有的器件用清洗玻璃器皿的去污剂清洗，并且用大量的蒸馏水冲洗。 经常使用高纯度的试剂及蒸馏水。第二部分 样品的预处理2.0样品预处理一般方法为了得到双向电泳最佳的结果，适当的样品预处理是

14、相当重要的。由于样品和原始材料的种类繁多，在这里只对样品预处理的一般方法进行介绍。最佳的对各种类型的样品预处理方法必须通过经验来决定。若样品预处理能使样品中的蛋白质完全地溶解、分离、变性以及还原，那是最理想的。当选用某种样品预处理方法时，对双向电泳要达到最终怎样结果有个清晰的把握是相当重要的。是否最终结果要尽可能地看到更多的蛋白质，还是仅仅想看到样品中感兴趣的蛋白质。额外的样品预处理能提高电泳最终结果的质量，但它能够使一些选择性的蛋白丢失。在这里应充分考虑提高样品质量和对样品进行完全的蛋白质预处理之间的相互关系。为了在复杂的蛋白混和物中辨别出特定蛋白，那些感兴趣的蛋白在电泳条件下必须是完全溶解

15、的。溶解不同种类的蛋白样品应采用不同的条件和措施：一些蛋白质在天然条件下与膜、核酸及其它蛋白质形成复合物；一些蛋白质形成各种非特异性的集合体；一些蛋白质当离开它们一般条件时就沉淀了。溶解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质溶解和浓缩的方法、去污剂的选择以及样品溶液的成分。在处理某种样品的时候，如果这些步骤中的任何一步没有充分完成，分离可能不能完全或失败，并且，一些信息也可能丢失。为了对细胞内蛋白作完全分析，细胞必须进行有效的破碎。细胞破碎方法的选择，依赖于样品是否来源与细胞、坚硬组织或其它生物材料以及是否要分析细胞内所有蛋白质或仅仅是细胞内小小的一部分。在2.1节中既介绍了缓和的破碎方法又介绍了

16、剧烈的破碎方法。在细胞破碎过程中，蛋白酶也可能被释放出来。蛋白质的水解增加了双向电泳结果分析的难度，因此在细胞破碎和随后的预处理中，样品必须防止被水解。在2.2节中，讨论了蛋白酶的抑制方法。如果只对组织或细胞中的一部分蛋白感兴趣，在样品预处理过程中可以采取预先分流的方法。如果想要分析的蛋白质来源于细胞器（细胞核、线粒体、原生质膜），感兴趣的细胞器应为进行双向电泳而进行蛋白质溶解之前采取差速离心或其它方法进行纯化。在进行双向电泳之前，样品可以在不同的抽提条件下利用溶解性进行预分流。参考资料8，9讲述了利用这种方法对样品进行处理。参照资料10可以获得蛋白质分流的相关主题。样品中蛋白质沉淀和干扰物质

17、去除是任选的步骤。是否采用这两步依赖于样品的自然属性和实验的最终结果。沉淀步骤在2.3节中介绍，它可被用来浓缩样品，也能被用来将蛋白质从潜在的干扰物中分离。除杂技术在2.4节中讲述，它可被用来减少来自样品的污染。如果，这些样品中的污染物不被除去，污染物有可能存在于双向电泳的最后结果中，这些污染物有盐离子、小离子分子、离子去污剂、核酸、多聚糖、脂类及酚类化合物。通常对样品的处理越简单越好，举例来说，低蛋白质浓度高盐浓度的样品能按常规的方法分析和稀释，或去盐，然后利用冻干的方法将其浓缩，或利用TCA和预冷的丙酮将其沉淀，然后用重水化溶液将其再溶。一般用重水化溶液简单地对样品进行稀释可能足够了。若蛋

18、白质浓缩存在问题或干扰物质干扰问题不能克服，有必要使用蛋白质沉淀和除杂技术。样品溶解液的成份对双向电泳极为重要，因为对第一向电泳而进行的蛋白质溶解处理必须既不影响蛋白质的pI值，也不能使蛋白样品存在于高传导性溶液中。通常，高浓度的尿素和一种或多种去污剂同时使用。样品溶解液在2.5节中进行探讨。常规样品处理原则：1 使样品处理的方法尽量简单、尽量避免蛋白质丢失。额外的样品处理能提高双向电泳最终结果的质量，但是有可能以丢失选择性蛋白为代价。2 细胞破碎的方法必须以最小限度地减少蛋白质水解和其它形式的蛋白降解为原则，细胞破碎有可能的话可在低温进行，并且减少破碎过程中热量的产生。理想的情况是，细胞破碎

19、应当直接在含有蛋白酶抑制剂的强变性溶液中进行。3 样品溶解液是新配制的或在冰冻情况下储存，使用高纯度或去离子的尿素。4 通过在等电聚焦（IEF）之前处理样品或将样品冰冻在-80冰箱内保存来保持样品的质量，避免使样品暴露而反复熔化。5 通过超离心方法除去所有颗粒物，固体的小颗粒必须除去，因为它们能堵塞凝胶的孔隙。6 为了防止蛋白质被修饰，不要在加入尿素时加热。当样品中存在尿素时，不要将样品处于37以上的环境中。提高温度能使尿素转化为氰化物，它能对蛋白质进行修饰。7 为了得到关于为使用IPG胶条而准备样品方面更多的资料，请参照11-13。2.1 细胞破碎的方法在表4和5中列出了标准的细胞破碎的方法

20、，包括破碎技术和所用的化学方法。细胞破碎必须在低温下进行。可能的话将样本放在冰块上并且利用预冷的溶液。如果这些方法被使用时，在细胞破碎过程中蛋白酶有可能被释放出来，因此，蛋白样品能防止被水解（参考2.2节）。直接将样品在高强度的变性裂解液中进行样品的破碎是可取的。这样能使蛋白水解酶迅速失活，并且也能使其它一些修饰蛋白的反应抑制。细胞的破碎往往在合适的能对感性趣的蛋白溶解的蛋白溶解液中进行。参考资料45，包含了常规组织破碎方面的信息。2.1.1常规细胞破碎方法 当感兴趣的样品是由易于溶解的细胞组成的（组织培养细胞、血细胞以及一些微生物），就用柔和溶解细胞的方法来破碎样品，这种方法在表4中列出。表

21、4 柔和破碎细胞的方法细胞破碎的方法适用材料一般过程渗透溶解这是一种非常柔和的方法，非常适用于被溶解样品降解成小细胞成分。血细胞组织培养细胞将细胞悬浮在低渗透液中。冻熔法许多种类的细胞通过对其进行一次或反复地快速冻结随后化冻的方法来降解。细菌细胞利用液氮将细胞迅速冻结后迅速化冻。如果需要，可反复进行。去污剂溶解法去污剂能溶解细胞的细胞膜从而降解细胞并释放内含物。将细胞悬浮在含有去污剂的裂解液中。细胞往往可以直接在样品溶液或重新水化液中裂解，因为它们含有去污剂。参照附录（溶液A），提供了常用的裂解液的配方。如果使用了诸如SDS这样的离子型去污剂，为了确保不干扰IEF，可以选择以下的步骤之一： 将

22、裂解的样品在含有过量的非离子或两性去污剂的溶液中稀释。 利用丙酮沉淀法,使SDS从样品中除去。（参表7，8和2.5 ）酶溶解法带有细胞壁的细胞可以用酶降解法除去细胞壁。这种方法的进行要有一种能降解被降解细胞的细胞壁的酶。植物组织真菌细胞在等渗透液溶液中用酶处理细胞。当只有一种特定的亚细胞成分（细胞内成分）要分析时，也可以用柔和的破碎方法。例如，选择反应的条件，只释放细胞质蛋白，或那些未接触的线粒体或其他的细胞器通过差速离心的方法也可取得。有时这些方法混合使用。2.1.2 剧烈的破碎方法 表5中列出了剧烈的破碎方法，当细胞不太容易破碎时可以利用这些方法来破碎，如硬组织中的细胞，或具有坚硬细胞壁的

23、细胞。剧烈的破碎法能彻底的破碎细胞，但是要避免在此过程中产生热量和泡沫。表5：剧烈破碎法细胞破碎方法一般步骤超声波破碎法通过超声波发生器产生的超声波的剪切力将细胞破碎。当达到最大的振幅时，剪切也越完全，但必须注意减少热量的产生和泡沫的形成。细胞悬浮液 短时间冲击细胞悬浮液避免产生热量，在超声波冲击过程中将样品放在冰上制冷法式压破细胞在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切力破碎细胞。带细胞壁的微生物将细胞悬浮液放入预冷的法式压力室中，施加压力并收集被挤出的破碎样品。研磨法一些类型细胞将它们放在研钵中利用碾槌手工能将它们打开。固体组织微生物组织和细胞用液氮冷冻，并将它们反复研磨成精细的粉末，

24、加入石英和细沙有助于研磨。机械粉碎法许多设备能用来进行组织的机械粉碎。手工操作的粉碎机（如 Dounce或Polfer-Elvehjem）能够用来破碎细胞悬浮液或相当柔软的组织。搅拌器或其它的电带动的设备能用来处理大的样品，样品粉碎很迅速并且对蛋白质很安全，除了在粉碎过程中一些蛋白酶的释放。如果需要，将组织切成薄片加入粉碎缓冲液（组织的3-5倍），迅速进行粉碎。利用过滤器或离心的方法将粉碎物澄清。滚珠粉碎法旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内含物。将细胞悬浮在等体积预冷的破碎液中，并转移到一支坚硬的试管内。每克湿细胞中加入1-3克预冷的玻璃珠，旋转液体一分钟并且在冰上冷却一分钟，这

25、样重复2-4次。2.2 防止蛋白质水解 当细胞被破碎后，蛋白水解酶就被释放出来或被激活。在蛋白质变性过程中，伴随着蛋白水解作用，使双向电泳最后结果复杂化，因此，必须采用一些方法来避免这些问题。如果有可能的话，直接将样品在强浓度的变性液中变性（8M尿素、10%TCA、或2%SDS）来抑制蛋白酶。在低温的时候，蛋白酶的活性低，因此，建议在样品预处理时尽可能地在低温下进行。此外，许多蛋白酶在pH 9以上就失活了，因此，Tris-碱、碳酸钠或含碱基团的载体两性电解质存在的条件下往往能抑制蛋白水解。 单独使用这些方法来抑制蛋白水解已足够了，然而有些蛋白酶甚至在这些条件下仍然保持着活性，在这种情况下应当使

26、用蛋白酶抑制剂。每一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此，建议复合使用蛋白酶抑制剂，在商界能得到很多种类的蛋白酶抑制剂。表6提供了常用的抑制剂及抑制的蛋白酶。请参照12，28，36-40获得关于蛋白酶抑制的更多方面知识。表6蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂有效的抑制的酶使用范围PMSF相当常用的抑制剂，使用浓度为1mmol/l。PMSF是不可逆抑制剂，能抑制： 丝氨酸水解酶。 一些半胱氨酸水解酶。PMSF在含水溶液中很快失活，在使用前现配。PMSF在含有巯醇类试剂（DTT或2-去巯基乙醇）时效果不好。这种缺点可以克服，通过将样品在含有PMSF缺少巯基醇类的去污剂溶液中破碎。含巯基类去污剂可以在最后步骤加入。PMSF毒性相当大。AEBSF使用浓度为4mmol/l。AEBSF在抑制行为上与PMSF相仿,但它更易溶于水并且毒性低。AEBSF具有修饰能力，能潜在改变一种蛋白的PI值。1mM EDTA