细胞工程重点归纳Word文档格式.docx

1、母液的配制和保存为了减少工作量，一般将常用的药品配成所需浓度的10100倍，在配制大量元素母液时一定要注意在混合各种盐时产生沉淀。主要注意下面几条：（1）各种药品要充分溶解后才能混合；（2）在混合各种无机盐时其稀释度要大，慢慢地混合，同时要边混合边搅拌；（3）在混合时要注意先后次序，把含钙离子的化合物要最后混合；（4）称量不同的化学药品时要用不同的药匙和称量纸，避免药品的交叉污染和混杂。（5）配制好的母液要标明母液名称、倍数、配制日期等，母液一般放在24冰箱中保存。配置流程：水、药品（母液）、糖、琼脂的准备混合加热溶解加入植物生长调节剂调整pH玻璃器皿的水洗和干燥培养液分装封口高压蒸汽灭菌冷却

2、凝固接种三、实验室的布局：要求、接种量、培养、光照、温度、消毒1.实验室包括五部分：植物细胞工程实验室一般可划分为五部分，即化学实验室、无菌操作室、培养室、鉴定室、驯化移植室。2.培养方法：固体培养、液体培养、悬浮培养、微室培养、液体浅层培养3.光照：对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。光照包括光照强度、光照时间和光波长短。普通培养室要求每日光照时间为1216h；光照强度约10005000lx；波长一般为普通日光灯的波长。培养物不同，对光照的要求也不同。对愈伤组织的诱导，黑暗条件有利于其生长；百合在黑暗条件下，长出小鳞茎，在光照条件下，长出叶片。器官的分化需要有光照，不同光波对器官分

3、化有密切关系，如烟草愈伤组织的分化，蓝光区起主要作用；壮苗培养要加强光照，有利于试管苗的移栽成活。4.温度：对培养物生长作用更为明显。培养室内温度低于15或高于35对培养物生长都不利。一般培养室内的温度控制在252。不同植物有着最适的生长温度，满足其特定的温度要求，便可以获得最佳效应。如食用仙人掌的培养温度，在35 时，生长速度最快。4、消毒：定义、流程、方式1.消毒是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常用化学的方法来达到消毒的作用。用于用于消毒的化学药物叫做消毒剂。（灭菌：是指把物体上所有的微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法，通常用物理方法来达到灭菌的目的。） 2.消毒

4、的流程（表面灭菌）：选材刷洗、冲洗用洗衣粉水或肥皂水浸并搅动自来水净洗衣粉水70酒精浸泡3060秒振荡0.1升汞310分钟无菌水冲先35次接种3.消毒的方式：包括三类：物理灭菌有紫外线消毒、湿热消毒、过滤消毒； 化学消毒法主要是依靠70%的酒精和0.1%升汞； 抗生素消毒法主要是添加青霉素、链霉素等抗生素。5、悬浮细胞培养：定义、生长曲线及各段特点、同步化、特点、操作程序悬浮细胞培养是将植物细胞和小的细胞聚集体悬浮在液体培养基上进行培养，它们在培养过程中必须保持较好的分散状态。细胞悬浮培养为植物细胞培养的工业化生产开辟了新的途径。2.生长曲线及各个阶段的特点：包括五个时期：滞后期：特点是细胞分

5、裂很少，其时间长短取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞的数量；指数增长期：特点是细胞分裂活跃，细胞数目迅速增加；直线生长期：特点是细胞生长和发育最快的时期；减缓期：特点是由于培养基中某些营养物质已经耗尽，或者有毒代谢产物的积累，细胞的增长逐渐减慢；静止期：生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。3.悬浮细胞的同步化：通过多次继代与筛选后，培养的悬浮细胞达到了一定的均一性，但仍是相对的，其中包含着十几至几十个细胞的细胞团，这样的体系仍不适于用来进行体细胞胚胎发生及其生理生化机制的研究，还必须要进行悬浮细胞的同步化处理，同步化的方法有二种：（1）分级过筛分离法：主要是根据

6、需要选取不孔径的尼龙网或不锈钢网，使生长停滞期的悬浮细胞依次通过，根据细胞团的大小将各组份分开。（2）不连续密度梯度离心法：主要是根据细胞团各组份的比重不同（不同的细胞团所含淀粉粒，液泡的多少，大小不同）而将其分开。Ficoll是蔗糖的多聚物，由于在较高浓度时其粘度和所造成的渗透压均较小，常被用来作密度梯度系统。4.作用和特点：（1）为人们在细胞水平上的遗传操作提供了理想的条件。（2）可在短时间内在细胞水平筛选出预期的突变体。（3）可直接用来进行原生质体的分离、培养与杂交、基因转移和次生代谢产物的生产等。因此，植物悬浮细胞培养已成为植物生物技术中一个最有用的手段之一。5.细胞悬浮培养的流程：（

7、1）选择合适的外植体外植体的选择对以后愈伤组织的诱导很重要，选择合适的外植体进而诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍效果。幼胚诱导愈伤组织的为最佳。因为幼胚诱导的愈伤组织质量最好，分化能力强（2）诱导疏松易碎的愈伤组织挑选那些颗粒细小、疏松易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织，经过几次筛选，继代至稳定，后用于诱导悬浮细胞系。诱导这类愈伤组织的关键是：外植体本身，附加的激素种类和浓度，基本培养基和附加产物等。（3）选择合适的培养基N6、MS、B5适合单子叶植物；MS、B5、LS、SL等适合双子叶植物。此外，悬浮培养与愈伤组织培养相比，所需要的营养物质更多，因此，在培

8、养基中加水解酪蛋白、椰乳、脯氨酸、谷氨酰胺等是十分必要的。还有，培养物生长迅速，pH下降快，故在培养基中要加入pH缓冲剂，如MES（2-吗啡乙基磺酸）等。（4）培养液的灭菌一般采用高温、高压灭菌（121、20min）。但过滤灭菌的培养基更有利于悬浮细胞的培养。因为高压灭菌时会造成：部分成分被破坏；pH发生变化，一般会下降；出现无机盐的沉淀（5）悬浮培养疏松易碎的愈伤组织放入盛有2040ml液体培养基的三角瓶中，在摇床上120转/分，251，黑暗或弱光下培养，23d更换新鲜培养基，注意细胞与培养基之间的比例。原有培养基与新鲜培养基比例为1：3。（6）悬浮细胞的继代培养与选择要得到均一的悬浮系，常

9、用的方法有三种：一是每次更换培养基时将培养物摇匀，稍静片刻，将上层培养基连同其中的小细胞团倒入另一无菌三角瓶中，弃去底部愈伤组织块或大细胞团，再待小细胞沉入瓶底，弃去大部分培养基，加入新鲜培养基。二是将培养物摇匀，静置片刻，用吸管取培养基中部的培养物，加入另一无菌三角瓶中，后加入新鲜培养基。三是过滤，将培养物通过一定孔径的尼龙网或不锈钢网（520um左右）过滤，尔后收集小细胞团进行继代培养。上述三种方法可结合使用，继代一段时间后便可进行一次筛选，直至建立起分散性良好、均一、生长迅速的悬浮细胞系为止。（7）悬浮细胞的同步化同步化的方法有二种：一是分级过筛分离法：主要是根据需要选取不孔径的尼龙网或

10、不锈钢网，使生长停滞期的悬浮细胞依次通过，根据细胞团的大小将各组份分开；二是不连续密度梯度离心法：主要是根据细胞团各组份的比重不同（不同的细胞团所含淀粉粒，液泡的多少，大小不同）而将其分开。Ficoll是蔗糖的多聚物，由于在较高浓度时其粘度和所造成的渗透压均较小，常被用来作密度梯度系统。（8）悬浮细胞的活力和生长速度一般继代培养（更换新鲜培养基）3天时的细胞活力最强，常常用此时的细胞为材料进行原生质体游离和培养及诱变处理等。（9）悬浮细胞愈伤组织的形成和植株再生悬浮细胞的分裂、分化通常有两个途径，一个是直接形成体细胞胚；另一个是先形成肉眼可见的愈伤组织，通过愈伤组织进一步再生植株。6、植物单倍

11、体培养：花粉、花药、优越性、特点、成功关键1.花药：是花丝顶端膨大呈囊状的部分，是雄蕊的重要组成部分。花药培养是指主要是选取花粉处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。另外各种植物最合适的具体时期，依植物种类品种不同而异。2.花粉：有花植物的小孢子，萌发时产生含三个单倍体核的雄配子体。将花粉从花药中分离出来成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉启动脱分化，进而发育成为完整植株的一种技术。3.对比之下，花粉培养比之花药培养有下列优越性：一是可以从较少的花药，得到大量的花粉植株；二是可以避免花药壁产生的体细胞愈伤组织的干扰，直接观察小孢子的发育过程

12、，为小孢子的发育、生理生化等基础研究提供方便。但是，小孢子的启动发育对药壁组织有相当大的依赖关系。4.花粉培养的优越性：虽然已经证明花药培养对诱导单倍体十分有效，但花药培养存在的主要问题是：植株不仅来自花粉，也有来自花药的其它不同部分，结果得到不同倍数性水平的植株群体。而花粉人工培养可克服这个困难。此外还有以下的优越性：（1） 消除了药壁和其它组织不能控制的影响，并能较好地调节支配发育的各种因素。（2）可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程。（3）由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料。（4）它不象单个愈伤组织细胞那样，花粉能直接转变成胚，因此对了解雄

13、核发育的物理学和生物化学是最为适宜的。（5）还能从每个花药获得更多的单倍体植株。5.成功关键：选择发育到特定时期的花粉进行培养是关键，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。7、体细胞培养：定义、人工种子、程序、萌发因素1.体细胞胚定义：是由体细胞发育成的胚。胚由受精卵发育而来。 又叫胚状体。是指离体培养条件下没有经过受精作用而形成的胚胎类似物，其培养包括器官外植体直接发生途径、悬浮培养细胞发生途径、愈伤组织发生途径、单细胞发生途径和原生质体发生途径。2.人工种子：就是将组织培养产生的体细胞胚或不定芽包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜，造成一种类似于种

14、子的结构。3.制作程序：选取目标植物从合适的外植体诱导愈伤组织把愈伤组织转移到液体培养基内愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织转移到无激素的培养基形成体细胞胚包裹人工种子温室播种获得目标植物4.萌发因素：影响人工种子萌发因素有：一是目前通过液体培养，特别是通过长期继代培养产生的体细胞胚多数不正常。所以形态完整、体积较大及具较高转换能力的高质量体细胞胚，是成功制作人工种子的保证。二是人工种皮的影响，目前广泛使用的藻酸盐胶囊通气性差，由于抑制了体细胞胚的呼吸，从而降低了体细胞胚的寿命。因此，寻找更合适的人工种皮的包裹材料，是人工种子研制中的重要任务之一。8、植物组培常见问题：污染、褐变、解决方案

15、1.污染：主要来源于外植体带菌或是培养基灭菌不彻底以及操作人员操作当中不慎造成。污染的解决方案：针对外源菌，严格按照无菌操作，取材选择嫩梢、新芽或胚作为外植体材料，对外植体进行彻底消毒；针对外源菌应采用，（1）改进外植体消毒方法，结合常规的消毒方法，采用间隙消毒法，即经过一般的消毒过程，把外植体放在不含激素和维生素的培养基中；（2）反复检查培养物，在初代培养成功后要反复检查，不要急于扩大繁殖；（3）应用抗生素2.褐变：细胞受胁迫条件或其他不利条件影响而死亡或细胞发生自然死亡；材料伤口分泌的酚类物质，在多酚氧化酶作用下氧化为醌类物质形成的。褐变的影响因素：基因型、材料的生理状态、培养基成分、培养

16、时间过长。褐变的解决方案：（1）选择合适的外植体，处于生长旺盛期，具有较强的分裂能力；（2）选择适宜的培养条件：温度，琼脂量、pH尽量处于适宜其生长；（3）细胞筛选和材料预处理；（4）使用抑制剂；（5）使用吸附剂。3.玻璃化：内源激素失调，能量代谢受阻，蛋白质的正常合成受抑，使分化难以顺利启动，细胞发育异常而致。表现为半透明状的畸形试管细胞，分化能力低，难以增殖成芽和成苗。玻璃化的解决和预防方案：（1）适当提高光照强度，有助于克服玻璃化；（2）注意通气，以尽可能地降低培养容器内的空气相对湿度和改善氧气供应状况；（3）适当降低培养基中NH4+的浓度；（4）注意细胞分裂素和生长素的的配合以及激素和

17、K+之间的配合使用；（5）控制温度，适当进行低温处理，避免过高的培养温度，可以消除玻璃化。9、植物脱毒：定义、操作、应用1.植物脱毒的定义：长期的无性繁殖在植物细胞内积累了大量的有毒物质，从而对植物的寿命，性状，产量等产生一定的影响。往往植物还容易的一些病害。所以，无性生殖的植物，需要经常脱毒。以加强植物的性状，防治一些病害。就植物脱毒而言，基本分为有性脱毒，无性脱毒两种。有性脱毒就是种子。无性脱毒，一般为组织培养。2.脱毒方法包括：物理方法：高温处理法（热汤处理法、热风处理法）、低温处理法。 化学方法：包括加入嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等化学药物抑制 体内病毒的复制； 生物方法：病毒无

18、法侵入植物的每一个部位，可选择不带有病毒的外植体 达到去除病毒的目的3.脱毒技术的应用：包括茎尖培养、微体嫁接法、愈伤组织诱导脱毒、珠心胚培养法、花药培养脱毒等。4.脱毒技术的鉴定：直接检测法、指示检测法、电镜法、抗血清检测法、分子检测技术。10、原生质体：概念、培养、应用1.原生质体的概念：脱掉了细胞壁的、仅有质膜包围、裸露的、活植物细胞。与完整的植物细胞相比，它有下列主要特点：游离的原生质体是真正的单细胞，在同一时间内能得到大量的遗传上同质的原生质体，用它可象细菌细胞那样进行多种遗传学研究。原生质体能超越性细胞的一些不亲和障碍，为较远缘的植物细胞杂交提供了融合亲本。2.培养：有以下几种方法

19、：（1）.液体培养法 ：是把纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中的培养方法。又可分为液 体浅层培养法和液体悬滴法二种。（2）.固体平板法 ：它是把原生质体均匀地埋入琼脂培养基中的培养方法。（3）.双层培养法 ：是在琼脂培养基上部加入一薄层液体原生质体培养液的培养方法。（4）.琼脂糖包埋法 ：同固体平板法。3.原生质体的应用基因工程上，通过细胞融合使杂交后代具有原不同原生质体的特性；组织培养上,可以用单个原生质体培养,获得再生植株；生物制药上,利用原生质体的结构,生产出一类药物,把药的有效成分包在原生质膜内,这样,药物进入体内后,就更易被人体吸收利用；微生物学上.现在可以运用原生质体融合技术构建我

20、们所需要的发酵菌株,这对于发酵工程中培育新的目的菌株,提供了一个重要的途径。动物部分归纳1、动物组织培养：概念、密度抑制、接触抑制、细胞系、细胞株1.动物组织培养的概念：指的是从动物组织或细胞从体内取出，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。包括细胞培养和器官培养。2.接触抑制：将多细胞生物的细胞进行体外培养时，分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触，即停止移动并抑制生长的现象。3.密度抑制：虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发

21、生密度抑制。4.细胞系（cell line）：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。5.细胞株（cell strain）：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。2、细胞生长方式、牛血清、培养基、培养法、传代培养。1.细胞生长方式：（一）贴附型细胞：（1）成纤维细胞型细胞：（2）上皮型细胞:（3）游走型细胞（4）多形型细胞，如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。（二）非贴附型细胞 （悬浮型）：有些细胞既可贴附生长，也可悬浮生长。这类细胞特点：胞体始终是球形、密度较高，培养效率高、易大规模生产。2.培养基：（

22、1）天然培养基直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。（2）合成培养基动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。无血清培养基不加动物血清，

23、在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。3.牛血清：牛血清分为胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。4.培养分类：原代培养：直接取自动植体的组织或细胞的培养；传代培养：从原代培养的细胞的继续转接培养称为传代培养。3、贴壁抑制、传代细胞、细胞冷冻及其原则、低温保护剂1.贴壁培养（attachment culture）是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。（1）生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅

24、速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养 表面，并形成致密的细胞单层。（2）优点：容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液；容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统；当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品；同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例；适用于所有类型细胞。（3）贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比：扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长2.传代细胞：适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。幼年动物的肾、肺、肝、卵巢、上皮、肌肉与肿瘤等组

25、织的细胞较易培养，而神经细胞则较难培养。原代细胞基础上通过胰酶等物质消化后继续用于细胞培养的细胞，它与原代细胞具有相同核型。这类细胞在体外可以无限制分裂。3.细胞冷冻：细胞培养的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。细胞冷藏的程序：（1）取处于对数生长期的细胞，倾去培养液，往瓶中胰蛋白酶消化处理，再加入培养液悬浮细胞（2）低转速离心，弃上清液，加入lml冻存培养液，吹打混匀成细胞悬液。（3）吸取少量悬液进行细胞计数，将细胞的浓度用冻存培养液调整到每毫升二至六万左右。（4）将细胞悬液移入冻存瓶内，在瓶上标明细胞名称及冻存日期；或用注射

26、器将细胞悬液注入到安瓿中，封完口后在安瓿上做好标记。（5）将冻干瓶或安瓿装入小布袋中，用棉线扎紧，挂上标签，然后放入4冰箱中处理两小时，-70 1-2天。（5）从冰箱中取出布袋，悬吊于液氮罐口内的气相液氮中放置两小时，然后将装有冻存瓶或安瓿的布袋移人液氮罐的吊筒内，迅速浸入液氮。4.细胞冷藏的原则：缓慢冷冻、快速解冻（慢冻快融）（1）缓慢解冻：原因是冷冻过快胞内水分来不及向细胞膜外渗出，胞内溶液中的水分结冰，造成物理损伤解冻程序：当温度在-25以上时， 12/min；当温度达-25以下时， 510/min；当温度达-100时，可迅速放入液氮中。（2）快速解冻：原因是解冻缓慢时，原有冰晶溶化后，

27、又会以新的晶核为中心形成更大的冰晶，称为水的重结晶现象。但采用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤。从液氮中取出冷冻管，快速放入37- 40水浴中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（40-60s）.5.冷冻保护剂：在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。原理：（1）.常用的低温保护剂是甘油和二甲基亚砜（DMSO），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点（2）.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时，促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀。（3）.稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。4、细胞融合（

28、体细胞杂交、原生质体杂交）、非对称细胞融合、细胞融合过程、细胞桥形成、实验方法、融合后细胞类型1.细胞融合又称体细胞杂交，是指将不同来源的原生质体，除去细胞壁的细胞相融合，将两个或多个细胞合并成一个细胞的技术。包括种内杂交细胞和种间杂交细胞2.非对称细胞融合：利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。3.细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合主要步骤。4.细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步，融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥。5.常用的诱导方法有三种：（1）生物法（仙台病毒诱导法等）； （2）化学法（PEG诱导法、Ca 2+诱导法、溶血卵磷脂诱导法等）（3）物理法（电诱导法等）6.融合完成的细胞类型 未融合细胞；同核体（由同一亲本细胞融合而来）；异核体（有不同亲本细胞融合而来，异核体其细胞膜融合在一起，而融合的细胞含有两个不同的细胞核）7、怎么利用融合和组培培养出番茄马铃薯8、单克隆抗体及其实验方案1.单克隆抗体概念：单个细胞通过无性繁殖得到化学性质单一、特异性强的抗体淋巴B细胞产生抗体，但不能体外培养，而瘤细胞能体外生长，但不产生抗体，两者通过细胞融合得到既可以产生抗体，又可以大量生产的抗体。2.实验方案：亲本细胞的准备细胞融合杂交瘤细胞的筛选可分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞