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1、您的第一反应可能是：我是否从贮液瓶中泵入了正确的流动相？在您确认无误后，您很可能就会说：“这根色谱柱肯定是坏了！”当然，从更常见的可能性入手，我们考虑了很多可能的原因。#1-检查我们的ChemStation工作站上设置的方法参数是否正确，#2-重新配制流动相，#3-更换色谱柱。最后，当然，这个问题的原因可能是我们最后才会考虑到的，这是一个仪器的问题insert ALS_Injection_ fix.gif自动进样器阀门的毛细管管线竟然连接错了！当然，您现在不太可能在实验室经常更换毛细管管线，但是在这种应用开发实验室里，在同一台LC上经常运行非常规的和往往差异很大的分析方法。多数LC仪器的模块化

2、设计和多功能性使更换色谱柱和组件非常方便。在本例中，有人point to someone off camera?错误安装了毛细管管线。讽刺地那排查故障可是太有趣了。我那天可是要有大量工作要做了。故障排查工作有时很令人沮丧，尤其是如果你沿着一个错误假设的方向走得很远的时候。因此，正如我们在许多视频片段中已经指出的，花些时间评估和缩小潜在原因的范围可以帮助您节省更多的时间。当然，这通常并不容易。要减少您自己的工作量可遵循一个很好的规律，即首先从最简单的事情入手。好的，让我们开始吧。我们将从较常见的原因和最容易的定位开始，排查使保留时间变化的潜在原因，然后再查找更复杂的原因并寻求解决方案。John

3、Henderson是安捷伦化学品与耗材部的一名应用科学家。Maureen Joseph是HPLC色谱柱的产品经理。导致保留时间变化的原因可能是:色谱柱老化色谱柱污染对应分析物的色谱柱/流动相组合不合适不充分的色谱柱再平衡流速或柱温的变化色谱柱尺寸或流速的变化有时人们会忘记在改变色谱柱尺寸的同时，需要调整系统和方法的参数来获得相似的结果。这些参数包括流速、梯度程序时间和进样体积。我们推荐使用LC方法转换软件帮助你实现这些。不同的仪器有不同的相应版本。请通过在A网页上搜索“LC方法转换器”找到适合自己的版本。这个软件会帮助您快速计算和调整系统/方法的参数以适应色谱柱尺寸的改变。该转换器尤其适用于梯

4、度分析方法的转移。我们在另一段视频中较深入地讨论了梯度洗脱分析，但在这里我们还要提一下，因为这是一个我们遇到一些困惑的问题。让我们看看这个例子show changing_column_length.gif。好，我们来看一个梯度分离饮用水中残留农药和阻燃剂的例子。我们假设色谱分析人员从上面的色谱图中认识到存在分离度过大的情况，并且想到如果使用较短的色谱柱就可以节约大量的时间。但当简单地更换为原长度一半的色谱柱后，分析时间也就一定会相应地减少一半吗？确实这样做后出现了最差的结果，几乎没有节约任何时间point arrow to timeline on lower chromatogram。为什么保

5、留时间没有像色谱柱长度一样减少50%？梯度程序时间保持了与原来相同的15分钟，并没有针对新的较短色谱柱的长度作出相应调整。所以正如您所看到的，保留时间并没有如您期望的减少。因为色谱柱的长度减少了50%，梯度程序时间也必须减少一半，以实现节省时间和保持相同分离效果的目的。现在，当我们改变梯度程序时间，减少一半来适应色谱柱长度和体积的变化时，我们看到分析时间也减少了一半show column_length_2.gif。这是证明相同原理的另一个例子，只是我们仅改变了流速来减少分析时间，而色谱柱长度不变。请看一张苯烷酮类化合物梯度洗脱分析的色谱图show flow_rate_example.gif。就

6、像我们在等度洗脱分析中常做的一样，我们增加了60%的流速来加快我们的分析，但我们发现分析时间并没有减少60%，而且保留因子也已经改变，事实上，它们竟然增大了！这里也是，我们需要调整梯度程序来匹配流速的改变。Insert gradient_adjusted_flowrate.gif show arrow to 8.2, 12.9 in each while John talks, to demonstrate they are the same 这是新的色谱图，这里您可以看到我们的保留因子已经调整合适，而且分析时间也已经减少了。这是一个很难理清的例子，并且凸显了故障排除可能会很复杂。流速确实改变

7、了，因此分析时间也应该发生改变，但结果却是出乎意料的。许多人可能会怀疑本例中的问题源于LC泵没有提供正确的流速。但这真的仅仅是一个您首先应该检查的分析方法上的问题。当我们改变了一个等度洗脱方法的流速时，分析时间与流速成比例地变化，而且保留因子保持不变。所以为什么保留因子会随梯度洗脱中流速的变化而变化呢？为了理解它，我们需要看一看梯度方程。show equation在梯度洗脱中，保留因子k*取决于几个参数包括流速、梯度程序时间和色谱柱柱体积等point to parts of equation as they are named，并且k*是与色谱柱尺寸成比例的！流速、梯度程序时间或柱体积的任何改

8、变都会改变k*或曰保留因子。Vm与柱长成正比，所以柱长的任何改变也都会改变k*。因此，当方法1转换为方法2时，要保持k*不变，这些因素必须平衡。insert equation1.giftG1F1/Vm1 = tG2F2/Vm2在我们的第一个例子中， insert equation2.gif 柱长减半，并且由于柱长与柱体积完全成正比，因此柱体积也减半了，所以梯度时间或者流速必须减半以保持方程的平衡；如果不这样做的话，即使采用较短的色谱柱也将几乎不能节省任何时间。在我们分析苯烷酮的例子中insert equation2a.gif，方法2中的流速（F2）增加了，但是梯度程序时间却没有调整，导致了保留

9、因子的意外增加。当我们减小60%的梯度程序时间来平衡方程并保持k*相等时，保留因子就一致了。谨记当您改变了色谱柱尺寸的时候调整系统和方法参数是非常重要的，如流速、进样体积、梯度程序时间。安捷伦LC方法转换器是一款很有用的工具。您可登录搜索到它。缓冲液和流动相我们下一个要涉及的话题是缓冲剂或流动相改性剂对您色谱柱性能的影响。每种缓冲液或流动相都对您色谱柱的保留能力有影响。由于色谱柱与这些缓冲液的相互作用，尤其是如果您在相同的色谱柱上使用了多种不同的流动相时，随着时间的推移您可能就会看到保留时间的漂移。如果您已经观看了这个系列的多段视频，您可能已经看到了Ron Majors所讨论的使用一个您经常使

10、用的标准品或者一个日常分析方法为您的新色谱柱建立一张色谱图重要性的那段视频。把这个色谱图放在手边将会有助于您的故障排查。我们上面的色谱图表明分离是按照预期进行的。随着时间的推移，由于诸如pH值、温度、不同种类分析物等方法条件的运行，色谱柱会逐渐磨损或老化。随着它的老化，保留时间会改变，就像第二张色谱图所展示的那样.在这个例子中，峰2的保留时间延长，峰3的保留时间缩短。甚至一段时间后，峰的洗脱顺序最终也发生了变化，就像下面那张色谱图所显示的那样。一些人由于对色谱柱的使用历史和运行方法不熟悉，可能认为色谱图中三个洗脱峰的顺序是正确的如同上面那张色谱图中的一样。依据已获得的进样次数与色谱柱寿命的相关

11、数据，一个延长色谱柱寿命的很好的手段就是使用保护柱。另一个相当常见的棘手问题是由于流动相的改变所引起的保留时间的变化。这是我最近使用ZORBAX快速分离高分辨HD色谱柱在1290 Infinity HPLC仪上所做的一个分析的例子insert equilibration_effect.gif:：注意当流动相改变时，峰形和保留时间是如何在各次运行间变化的。back to John有时流动相的不同，仅仅是简单的因为在您的实验室中溶剂的混合方式不同造成的。demonstrate with three 100mL graduated cylinders如果您要配制50/50的甲醇/水混合液，这是保证最

12、佳准确度的配制方法。在混合它们以前，用干净的玻璃量具分别准确量取一定体积的每种溶剂非常重要，因为甲醇和水混合溶液的体积小于溶剂各自体积之和。请看这里，如果您采用自动混合，混合液的总体积会发生变化。因此，这两种方式所配制流动相的组成有区别。一段时间后，流动相组成也会发生改变或者可能被污染，微生物例如细菌或藻类可以在静止的含水流动相中生长，至少可能会改变流动相的pH值，或者在流路中产生微粒，在最坏的情况下可能会严重污染色谱柱。给流动相脱气也是至关重要的。溶剂中溶解的气体可以从溶液中溢出，在流路中形成气泡，这可能会干扰输液泵、色谱柱或者检测器的性能。让我给您展示一下在100 mL甲醇水混合溶液中溶解

13、了多少气体put in ultrasonic bath。幸运的是大多数LC系统都装配有在线脱气机，但是如果脱气机被绕开或者缺失，那么在溶剂使用前就一定要通氦气或使用其它的方式进行脱气。好的，那么我们的下一个话题是什么呢？让我们讨论一下色谱柱的再平衡吧。随着时间的推移，缓冲液和流动相会影响您色谱柱的保留能力。保留一张使用标准的或者您常用的方法分析得到的反映一根刚从盒子中取出的新色谱柱性能的谱图，您就可以定期比较评价色谱柱的性能了。使用保护柱是一种很好的延长您分析柱寿命的方式。流动相的改变可能会改变保留时间。有时，流动相组成会因为在实验室中混合方式不同而产生差异。随着时间推移，流动相也可能被污染。

14、给流动相脱气是防止气泡进入流路并造成保留时间漂移的一种很好的做法。色谱柱的再平衡充分的色谱柱平衡对于方法建立和方法转换时保证组分保留时间重现性是很有必要的。请看这个柚子汁分析中的梯度分离show gradient_grapefruit.gif，我们可以看到色谱柱的柱体积和时间长短对色谱柱再平衡的影响with pointer at the beginning, and an icon for “column volume”，再看这里show area at end of chromatogram, with more column volumes indicated。这是在运行完上一个梯度程序后

15、，色谱柱返回到起始流动相条件所需要的时间。在本例中，柱平衡时间是1.4min，相当于4倍柱体积。色谱柱柱体积是通过查看色谱图并测定色谱图上从开始到基线上出现第一个扰动峰所需的时间来得到的。show pointers on screen以分钟为单位记录该时间并且乘以用mL/min为单位的流速，从而获得柱体积的毫升数。show pointers on screen从经验上来讲，方法开发中我们一般使用十倍柱体积的溶剂平衡色谱柱，但是对于已经建立的方法，柱平衡时间是可以评估和缩短的，例如，就像本例中使用的4倍柱体积。最少的平衡时间必须通过反复试验来确定，即通过反复运行梯度程序并考察相应保留时间的变化来

16、判断。如果几次重复进样的结果完全相同，show gradient2.gif就像本例中那样，那么平衡时间就足够了。为什么必须通过反复的试验呢？这里主要有两个原因：1）首先，色谱柱，或者更确切地说是固定相，回到初始条件的再平衡速度是不同的。多快或多慢来进行再平衡取决于流动相溶剂和缓冲液的性质，以及所使用梯度的溶剂比例范围。这就是为什么在方法建立时推荐使用10倍柱体积溶剂冲洗的原因，为了确保下次实验运行时固定相已充分再平衡。在分离效果令人满意后，这个再平衡过程可以缩短。我使用的一个窍门就是注意观察在线信号窗口的压力线show。压力会随着流动相组成的变化而变化。当压力线返回到初始值时，您就知道这已经接

17、近完成再平衡了。2）第二，因为色谱柱的死体积包括仪器的延迟体积，这个附加的体积也会因仪器的不同而不同。让我们看一看这台仪器的延迟体积。show instrument dwell volume on screen延迟体积对等度洗脱方法中的保留时间没有影响，但是在梯度洗脱方法中，它对保留时间有显著的影响。如果您将一个仪器的梯度洗脱方法应用到另一台仪器上，保留时间产生了变化，请比较这两个系统的延迟体积。两个系统的流路体积越接近，保留时间也将会越一致。在梯度洗脱中，色谱柱的再平衡是保证您方法的重现性所必需的。可以通过以下步骤测定您色谱柱的柱体积：- 测量色谱图上从开始到基线上出现第一个扰动峰的时间。-

18、 以分钟为单位记录该时间并且乘以用mL/min为单位的流速，从而获得柱体积的毫升数。一个通用的规则是在方法建立时，使用十倍柱体积的溶剂平衡色谱柱，但是对于已经建立的方法，柱平衡时间是可以评估和缩短的。最优的平衡时间需要通过反复的试验来确定，即通过反复地运行梯度程序并考察相应保留时间的变化来判断。小结那么，现在我们做个总结吧。如果您发现保留时间变化了，记得首先要查明问题的来源。问题可能来自仪器、色谱柱，或者流动相。对您系统的初始性能有深刻的了解和详细记录，包括色谱柱在内的系统的初始性能，使用新鲜配制的流动相和刚从盒子中取出的新色谱柱，采用您的分析方法制备一张色谱图放在手边作为参考，是保持方法的高

19、水平性能和发现保留时间变化，或者任何其它色谱问题的非常好的一种手段。如果您看到了保留时间的变化，首先要审查您的分析方法。是否您改变了色谱柱的内径或长度，或者改变了您方法中的另一些参数？如果您在梯度洗脱方法中改变了色谱柱规格，您将需要平衡其他影响保留时间的因素：梯度程序时间、流速和柱体积。说到流动相，请确保您使用了一致的方法来量取和混合流动相。而且如果您使用的是梯度洗脱，您需要考虑的另一个潜在的问题来源是色谱柱的再平衡。在方法建立期间测试并确定再平衡需要几倍柱体积的流动相。如果您考虑了这些问题并且仍然需要帮助，您可以随时联系安捷伦技术支持。您可以登录A url on screen保持保留时间一致的技巧：- 了解您的色谱柱，并且在色谱柱全新的条件下制作一张反映其性能的样品色谱图，一段时候后用作参考比较。- 如果您改变了色谱柱的尺寸，一定要注意调整您的方法参数，您可以使用LC方法转换器来帮忙。- 确定您使用了一致的方式混合流动相。- 如果您使用的是梯度洗脱，在建立新的分析方法时，请测试并确定色谱柱再平衡需要几倍柱体积的流动相。