基因操作原理Word格式.docx

1、酵母双杂交（Yeast two-hybrid system）是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。反式转录激活因子，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合功能域（BD）和转录激活结构域（AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性，使启动子下游基因得到转录。根据这个特性，将编码BD的基因与已知蛋白质的基因构建在同一个表达载体BD-protein上，将编码AD的基因和蛋白质文库的基因构建在AD-表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，表

2、达两者的融合蛋白。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落，研究活细胞内蛋白质相互作用。信号标签诱变技术（Signature-Tagged Mutagenesis ,STM）是一种在突变基础上鉴定病原微生物毒力基因的阴性选择方法。其基本原理是在病原体致病过程相关的毒力基因中插入特异性标签的转座子,产生的突变体由于毒力基因的插入失活而无法引起病原菌持续性感染,结果导致病原体不能在宿主体内存活下来。通过突变体库感染宿主,然后对存活下来的突变体进行负筛选就可鉴定出病原体的毒力相关基因。该方法可以证明微

3、生物在感染过程中可能涉及到的基因,及其基因对微生物在体内的增殖具有重要意义。反向PCR反向PCR（reverse PCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。SH技术（subtractive hybridization）mRNA减法杂交（subtractive hybridization）技术又叫做差减cDNA克隆。它是通过构建差减文库（subtractive library）得以

4、实现的。定义： 减法杂交是用过量的参照细胞的mRNA或cDNA与目的细胞的cDNA或mRNA（又称目的序列）杂交，形成的RNA-cDNA杂交体是两种细胞共有的，将其扣除。剩下的cDNA或mRNA可以标记成探针（称减法或扣除探针），从前述的目的细胞的cDNA文库中筛选目的克隆；还可以用来构建文库，即减法文库。减法文库实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA。文库中含有的是特异表达的cDNA克隆及其他一些低丰度的mRNA的cDNA克隆。原理： 减法杂交的本质是除去那些普遍共同存在的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。减法杂交工作原理：从表达目的基因的组

5、织（以下简称+）提取mRNA所转录为cDNA，然后与无目的基因表达的组织（简称-）提取的mRNA做过量杂交，在+、-组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。抑制差减杂交（ suppression subtractivehybridization , SSH）抑制差减杂交（ suppression subtractivehybridization , SSH） 是基于抑制PCR 和差减杂交技术建立的简单有效的方法,通过一次差减杂交可使低丰度的序列（mRNA） 得以高于1000 倍的富集,

6、有效的选择性扩增目标序列,同时抑制非目标序列的扩增,因此在分离基因特别是分离低丰度差异表达基因方面具有更广阔的应用前景。SSH 技术主要原理是以抑制PCR 为基础的cDNA 消减杂交。所谓抑制PCR 是利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对,选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。在经过消减杂交后,根据复性动力学原理,浓度高的单链cDNA 分子迅速复性,浓度低的单链cDNA 分子仍以单链形式存在,使得杂交后不仅目的基因间的丰度差异基本消除,而且富集了差异表达基因。19. Pyrosequencing技术焦磷酸测序（Pyrosequencing）

7、技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。该技术是新一代DNA序列分析技术，无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。20. 易错 PCR（error prone PCR）易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。然

8、而，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR （sequential error prone PCR）策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变积累而产生重要的有益突变。21. DNA shuffing 又称为DNA洗牌技术，先通过DNaseI对目的基因切割成随机片段，然后进行PCR重聚，由于同源重组而产生基因突变的方法，点突变率可以达到0.7 基因组shuffling：基因组改组（GenomeShuffling）技术在细胞群体层次上进行反复重组、选择，是定向进化领域的最新进展。与DNA shuffli

9、ng类似，操作对象为单染色体组成的基因组。合成shuffling：人工合成的很多同源性很高的片段，人为的改变某些碱基，有意识，有目的的改变某些位点，得到多样性的突变库的一种技术。22. 功能互补筛选:一组含有大肠杆菌基因组全部基因序列结构的重组体DNA分子的异源群体,导入一种大肠杆菌营养缺陷型的受体细胞,然后将受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需的底物的培养基上 ,因此只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会生长成转化子菌落. 23. 分子进化工程：由DNA序列在试管中重排而最终导致蛋白质或RNA的体外定向进化，完成这一体外进化的过程称为分子进化工程。27. 随机诱变：突变发生的位置在很大程

10、度上难以控制，突变后基因的功能难以预测，但产生的突变类型非常丰富。28. 体内诱变:利用温度敏感型大肠杆菌,28正常生长,37不能生长,因为DNA聚合酶失活.RNAi：是指双链RNA（doublestrandRNA,dsRNA）导入细胞后,使mRNA由于序列互补出现特异性降解,从而阻断该基因表达的现象。SGE：淀粉凝胶电泳RNaseH：一种降解RNA2DNA 杂交链中RNA 的酶,产生5-磷酸和3-OH 端。RNase H酶切产物因缺少5-cap 和3-poly A 尾而被细胞中的5和3外切酶降解。Knockout：基因敲除，是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去

11、除，或用其它顺序相近基因取代，可中止某一基因的表达。1.基因克隆的宏观策略1） 已知序列同源性的基因的克隆（PCR方法克隆目标基因） 根据已知基因序列信息设计引物，以基因组DNA为模板，扩增出目标基因。2） 定位在质粒上的基因克隆（杂交方法）利用识别六碱基的限制性内切酶（根据A 来源选择）酶解质粒DNA，电泳分离，然后用特异性探针进行杂交，确定基因片断进行克隆。3） 定位在染色体组上的基因克隆杂交方法.用识别四个碱基的限制性内切酶对染色体DNA进行部分酶切，建立基因文库。再用标记特异探针进行探测，确定目标基因片断，再进行克隆。.利用亚基因文库进行克隆先进行分子杂交，确定基因片断范围，在进行克隆

12、筛选。放射免疫法 利用散弹法和表达载体建立基因表达文库；利用目标蛋白质制备抗体，对基因表达文库进行筛选，可直接获得完整的基因。利用简并引物的PCR方法 对目标基因的蛋白质进行N-端分析。根据AA序列设计简并引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标基因。转座子插入失活克隆法用Tn对目标生物进行突变，筛选突变株，抽提突变株基因组DNA，利用Tn序列信息设计特异探针，进行TAIL PCR双向扩增，从而获得完整基因。 质粒拯救法 利用带有复制起始位点（origin）的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解、连接、转化和测序（Gene trapping technique）功能克隆法（基

13、因表达产物应用明显的表型效应） 利用目标基因表达产物的表型效应，从基因文库中筛选目标基因。通过双杂交系统克隆新基因 通过靶标蛋白利用双杂交系统克隆与该靶标蛋白作用的蛋白质基因。通过蛋白质组学技术克隆基因:通过肽片断序列获得蛋白质信息，从而在基因组中找到基因位置和序列，根据序列设计引物，扩增克隆该基因2原核生物表达所需基本元件，功能是什么？（1）启动子：Sextama box: 也称35序列,识别序列。其中心位于起始点上游大约35bp处。其共有序列为TTGACA.是RNA聚合酶识别序列的一部分（初始结合位点），RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点。Pribnow box: 也称-10序列，在起始点的

14、上游。其共有序列为TATAAT，碱基的保守性在45%到100%之间变动。是RNA聚合酶的牢固结合位点，在Pribnow框内DNA的双螺旋解链17个核苷酸左右，与RNA聚合酶形成所谓开放性启动子复合物，从而使RNA聚合酶定向，行使其转录功能。CAP位点：细菌中许多基因的表达存在一种正调控机制。细胞内缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将ATP转变成cAMP, cAMP与其受体蛋白CAP结合成复合物，这个复合物再与启动子上的CAP位点结合。这样启动子上的进入位点方能与聚合酶结合。（2）终止子：一个或多个发夹结构，连续的6个U是RNA聚合酶从模板上解离下来的信号。 不依赖因子的终止子：回文序列中富含GC碱基对

15、，在回文序列的下游方向又常有68个AT碱基对，会文序列下游紧连着又一串U。RNA聚合酶在转入延伸过程中遇到回文序列后会出现一次延宕，由于回文序列中富含GC，使得延宕时间延长，又由于回文序列下游的一串U使RNA聚合酶与模板的结合能力下降，从而使转录终止。 依赖因子的终止子：会文序列中GC含量较少，回文序列下游方向的序列没有固定特征。因子的活性形式为一六聚体，具有 NTPase活性。因子可能结合正在合成中的RNA链的5端，通过水解NTP放出的能量向3端移动，在RNA聚合酶发生延宕的时间内追赶上RNA聚合酶，后与RNA聚和酶相互作用而造成转录的终止。 （3）SD序列：核糖体结合位点。mRNA中5端富

16、含嘌呤的短核苷酸序列,一般位于mRNA的起始密码AUG的上游510个碱基处,并且同16S rRNA 3端的序列互补。（4）起始密码子：AUG（5）终止密码子：UAG UAA UGA（6）调节基因：位于启动子的上游，编码调节蛋白，阻遏蛋白与操纵基因结合阻止基因表达，诱导蛋白结合在启动子区域，加强基因的表达。（7）操纵基因：与阻遏蛋白结合，终止转录。3设计从某一原核生物或真核生物克隆某一基因的技术路线原核生物：DNA片段制备-插入载体-转入寄主细胞-筛选真核生物：mRNA preparation - Reverse transcription in vitro - cDNA preparation

17、 - cDNAlibrary - Screening4无细胞蛋白合成体系有哪些，用途？无细胞蛋白合成体系是指没有完整的细胞，但是具备完整细胞所拥有蛋白质合成的酶系和因子。（1）大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统：理论上任何遗传信息都可以在大肠杆菌体外表达体系中被翻译成多肽。E.coli体外表达系统耐受性高，用来合成标记的蛋白最合适不过。这种体系的弹性就非常大，可以加入许多其它优化成份以提高产率和提高溶解性。原核生物（2）麦胚无细胞蛋白质合成系统：由于内源的mRNA很少，这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。此系统广泛用于放射标记多肽

18、和蛋白的合成。合成量不太高，直到最近才通过延长合成时间的方式提高了产率。麦芽提取物系统和大肠杆菌系统都适合进行高通量的蛋白质组学研究。植物（3）兔网织红细胞无细胞蛋白质合成系统：网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，可减少背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少，有助于长链RNA的稳定（包括有帽子或者没帽子结构的RNA），因而可以合成较大的蛋白。网织红细胞体系是最有希望做到微粒体糖基化的体系。兔网织红细胞体系一般有2种，处理过和

19、未处理过的。由于兔网织红细胞虽然没有细胞核，依然有内源球蛋白mRNA，可通过外加钙离子依赖的核酸酶处理除去内源球蛋白mRNA，并通过EDTA处理使核酸酶失活。经过处理的兔网织红细胞体外表达体系背景更低效率更高。未经处理的兔网织红细胞裂解物往往用来研究翻译机制，或者研究球蛋白翻译的抑制物等等。动物5限制性内切酶的作用特点是什么？答：根据酶的组成，识别和切割的位点及是否需要辅助因子可将限制性内切酶分为三类：类限性内切酶由3种不同的亚基组成，兼具有修饰酶活性和限制性内切酶活性。它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切割识别位点以外的DNA序列，作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP.类限制性

20、内切酶占内切酶的绝大部分，由修饰酶和切割酶组成，识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA双链，产生3-OH和5-P基团的DNA产物，反应需Mg2+，不需ATP.类限制性内切酶种类少，所占比例不到1，识别序列为5-7bp的非对称序列，在识别位点下游24-26bp处切割DNA，反应需ATP。R. E. type酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能二亚基双功能酶识别位点4-6bp大多数为回文对称结构二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制反应是否需要ATP

21、NoYesDigestion types: 1. Same sequence/same sites 2. Same sequence/different site 3. Different or same sequence/different or same site不同限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种情况：1.产生3突出粘性末端。2.产生5突出粘性末端，3.产生平末端，另外，有些限制性内切酶还具有星星活性，即在极端的条件下，如高PH值和低离子强度下，限制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列的序列。最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列中碱基的缺失。6Dpn用于定点诱

22、变的原理是什么？方法限制性内切酶Dpn用于定点诱变是因为它所识别和切割的位点为TCGmATCG，而来自于大肠杆菌的质粒就具有这种序列。PCR扩增时，引物与预发生诱变的模板之间具有单个碱基的错配，扩增结果使错配进入到模板序列中。由于扩增产物不含有Dpn识别的甲基化位点，而原先的模板质粒DNA则具有这种位点，所以Dpn就会切割消化模板DNA，而新扩增的DNA则不会被消化。若再以扩增的DNA为模板合成其互补链，则互补链就为实现定点诱变的DNA。方法：1. 加热变性质粒DNA，然后退火使含有突变位点的引物与质粒DNA配对。 2热循环扩增渗入突变的引物，产生有缺口的环状链。 3用Dpn降解模板链 4将退

23、火形成的有缺口的双链DNA分子转化到大肠杆菌XL1-Blue中 5XL1-Blue E. coli 细胞修复缺口，成为定点突变的质粒DNA7定点诱变有哪些方法，其原理是什么？（8P9）（1）异源双链法定点诱变预先设计含A B C3个不同的酶切位点的质粒，其中A B较近，C离A B较远，在B处设计有引物结合位点；对该质粒分别进行C酶切和A B酶切，核酶外切酶法定点诱变PCR介导：（1）单引物突变；（2）互补引物突变；（3）多引物突变（多位点诱变）；（4）饱和诱变定点诱变技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用。

24、8基因操作中最常用的修饰酶有哪些，适用于何处？工具酶基因操作中最常用的修饰酶有：（1）内切酶和外切酶（2）甲基化酶（每一种限制性内切酶都对应一种甲基化酶）甲基化酶可在其识别位点内引入甲基，用于保护DNA不被相应的限制酶所切割。通过甲基化修饰还可产生新的酶切位点。Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。（3）连接酶T4 DNA连接酶可以催化DNA 5-P和3-OH之间形成磷酸二酯键，用于DNA 的粘性末端和平末端连接；E.coli DNA连接酶作用需NAD+的参与，常用于DNA的粘性末端连接和cD

25、NA的克隆；T4 RNA连接酶可以催化ssDNA或RNA的5-P与另一ssDNA或RNA的3-OH之间形成共价连接，可用于标记DNA和RNA的3末端，单链DNA或RNA的连接。（4）DNA聚合酶（依赖于DNA的DNA聚合酶）大肠杆菌DNA聚合酶具有三种活性：53DNA聚合酶活性；53外切核酸酶活性；35外切核酸酶活性。利用其53外切核酸酶活性可用切口平移法标记DNA；用于cDNA克隆中的第二链；对3-突出末端的DNA作末端标记。Klenow DNA聚合酶具有聚合活性和35外切核酸酶活性，可补平有3凹端的DNA，对DNA进行末端标记，在cDNA克隆中合成第二链T4 DNA聚合酶与Klenow D

26、NA聚合酶相似，35外切核酸酶活性更强，在诱变反应中很有用。T7DNA聚合酶与T4DNA聚合酶一样，用于长链合成Taq DNA聚合酶：且有聚合酶活性和35外切酶活性（5）T4多核苷酸激酶（PNK）：该酶主要用于对缺乏5-P的DNA或合成接头进行磷酸化（消耗ATP），同时可对末端进行标记（先去磷酸化ADP-ATP，再磷酸化ATP-ADP）。（6）碱性磷酸酶（小牛肠碱性磷酸酶，CIP）：该酶催化去除DNA或RNA的5-P，防止DNA片段的自身连接。用该酶后要进行纯化，避免残留，可凝胶电泳、回收。标记探针，增 加阳性克隆。（7）末端脱氧核苷酸转移酶：该酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端，可在cD

27、NA或载体的3端加Poly（N），用于克隆，Pu加Mg2+，Py加Co2+。用于3末端标记、构建PCR载体（+T），PCR产物通常多-A。（8）依赖于RNA的DNA聚合酶 AMV（骨髓细胞瘤病毒）反转录DNA聚合酶：cDNA合成；RNase H活性（pH8.3，对pH敏感） M-MLV（鼠白血病病毒）反转录酶：42失活。（9）依赖于DNA的RNA聚合酶（Sp6、T7、T3 RNA聚合酶，特异启动子）该酶为转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，无需引物。用于单链RNA探针；合成mRNA用于体外蛋白质合成；T7表达载体。（10）反转录酶用途主要有：做cDNA克隆；测转录起始点；5突出DNA的补平和标记；双脱氧终止法测序；RT-PCR等。（11）核酸酶Bal3核酸酶：主要活性为3外切核酸酶活性（Ca2+），可从线性DNA两条链的3端去除掉单核苷酸，达到两头缩短DNA的目的，用于缺失突变；也可用来制作DNA限制酶切图；单链外切酶活性（无Ca2+）S1核酸酶：可降解单链DNA或RNA，产生带5-P的单核苷酸或寡核苷酸双链，可用于分析DNARNA杂交体的结构，去掉突出的单链尾以产生平末端；降解