中国动物药材DNA条形码数据库文档格式.docx

1、序列对金钱白花蛇及其常见混伪品进行 DNA 条形码鉴别研 究，结果表明， 金钱白花蛇 COI 序列可以明确地与混伪品区 分开6 。胡嵘等对海马、海龙及其混伪品共 14 个种 20 份样 品的 COI 条形码序列进行研究， 结果表明运用 COI 序列能够 准确鉴定海马、海龙的基原动物及其混伪品 7 。此外，还开 展了龟甲、鳖甲、鹿茸以及蛤壳等的 DNA 条形码研究工作8-11 。动物 DNA 条形码分子鉴定研究工作的大量开展，为 构建中国动物药材 DNA 条形码数据库奠定了基础。DNA 条形码数据库不仅是存储样品信息和 DNA 条形码序列的工具，而且是 DNA 条形码研究和物种鉴定分析的生由国际

2、生物信息学平台，对推动 DNA 条形码研究发展具有重要意义12。第一个国际 DNA 条形码数据系统（ BOLD ）命条形码联盟（ CBOL ）于 2007 年建立 13 。此外Barcode of Life Campaign （ FISH-BOL ， http： /www.fishbol.org/ ）， Lepidoptera Barcode of Life （ http ：/lepbarcoding.org/ ）， Mammalia Barcode of Life Campaignhttp ：/www.mammaliabol.org/ ）。此外，邵鹏柱等初步构建 了传统药物 DNA 条形码数

3、据库（ http ：/137.189.42.34/mherbsdb/ ），包含 1 661 个物种， 36 679 条序列14 。当前，我国尚未构建统一的动物药材 DNA 条形码数 据库，制约了 DNA 条形码技术在动物药材鉴定、资源可持 续利用和濒危物种保护中的进一步应用。1材料 中国动物药材 DNA 条形码数据库中的序列来自于课题组联合相关研究者所开展的动物药材 DNA 条形码分子鉴定 研究及 GenBank ，包含 800 余种动物药材和大量动物药材混 伪品及密切相关物种（表 1 ）。2方法 对包含测序峰图的样品， 根据 Q 值进行单碱基和序列质量检测。对不包含测序峰图的样品，使用 EM

4、BOSS Transeq将核酸序列翻译为蛋白序列，利用隐马尔可夫模型（ hiddenMarkov model ，HMM ）进行 COI 条形码区域核验 13 。采用BLAST 分析防错、系统树分析防错和 Barcoding Gap 检验防 错等核验 COI 序列的可靠性 2 ，使用 Muscle 3.8 进行多序 列比对 15 ，使用 Paup 4.0进行遗传距离计算 16 ，使用MEGA 6.0构建NJ （邻接法）系统聚类树17。使用BLAST 方法进行物种鉴定分析，使用 MySQL 进行数据库管理，通 过 MySQLdb 连接 MySQL 数据库。3结果与讨论品数据库、序列数据库和文献数据

5、库构成。样品数据库包含完整的样品采集和鉴定信息，即：样品编号、分类信息、凭证信息、采集者、采集地、鉴定者、 1 张到数张样品及生境“spp.”等字符的Record。提取Record注释中基因名称为“COI ”或“ CO1”区域的序列，女n Record来自于已发表的文献，收集该文献的 PubMed ID 、题目、作者、期刊、摘要 等信息构成文献数据库。此外，文献数据库还包含本课题组 联合相关研究者所开展的动物药材 DNA 条形码分子鉴定研 究文献。中国动物药材 DNA 条形码数据库包含 2010 年版中国药典 18 和中国药用动物志 （第 2 版）19 所载 800余种动物药材和大量动物药材的

6、混伪品和密切相关物种的样品采集、样品处理、 DNA 提取、 PCR 扩增、测序、序列每 6 个月更新 1 次。新增加样品如包含测序峰图，则依照中 药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则去除测序峰图两端的低质量区域2，即：以20 bp的窗口分别从序列 5 端和3端种鉴定系统 未知样品可以通过中药材 DNA 条形码鉴定系统 进行鉴定，其访问地址为 。任何对中国动物药材 DNA 条形码鉴定感兴趣的单位和个人，均可将获 得的未知样品 COI 条形码序列粘贴到物种鉴定模块的查询 框，然后点击提交进行鉴定。查询 COI 序列的长度须大于300 bp，且序列所含不确定碱基 （Ns）的数目应小于1%。当前，该系

7、统支持Fasta （含“ ”号）格式和纯序列格式（不与未知样品序列最相似的序列，并给出数据库中该序列的物 种信息。为便于使用者对鉴定结果进行核对，物种鉴定系统 同时列出了数据库中与查询序列相似性最高的前 20 条序列， 并列出序列相似性、分值、 E 值及比对信息（图 2）。4结论 动物药材是我国传统医药的重要组成部分，在我国已有两三千年的应用历史，从秦汉时期的神农本草经 ，到历 版中国药典都收载有动物药材，据第三次中药资源普查 结果，我国药用动物有 11 门， 415 科， 861 属， 1 581 种 我国动物药材多数来自野生，资源有限，部分药材的基原动 物如穿山甲、赛加羚羊、梅花鹿等已被列

8、入国家重点保护 野生动物名录（httP: /）和濒危野生动植物种国际贸易公约 附录 （ http： / ）。此外， 除使用动物全体的药材外，动物药材多取自动物的不同组织 或器官，例如:角、甲、壳、骨、皮等，形态鉴定特征不完 整，给动物药材的性状鉴定带来较大困难 20 。 DNA 条形码鉴定快速准确、有望实现自动鉴定，是传统生物鉴定方法的 有效补充，应用前景广阔 1 。本研究首次构建我国统一的中国动物药材 DNA 条形码数据库，对动物药材鉴定、资源可材 DNA 条形码数据库也为自动化动物药材鉴定仪器的开发 奠定基础。随着我国动物药材 DNA 条形码鉴定研究的深入开展，动物药材 DNA 条形码鉴定

9、研究的参与单位和参与者逐渐增 多，越来越多的动物药材品种被研究和测序，许多制约大规 模 DNA 条形码数据库构建的障碍也逐渐消除。随着测序费 用的逐步降低，特别是高通量测序技术的普及和应用，可以 用极低的成本在短时间内获得大量样本的条形码序列。此外，计算机及网络技术的发展为动物药材 DNA 条形码库的 条形码库收载动物药材的种类还比较有限，部分动物药材的COI序列来自于GenBank。将来，课题组需要联合相关研究者，依照中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则的标准操作 规范，一方面增加数据库中动物药材的种类，另一方面增加 数据库中动物药材样品的数目，进一步完善中国动物药材DNA 条形码数据库。

10、加拿大动物学家 Paul Hebert 等21 对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动物共 11 门 13 320 个物种 COI 基因序列比较分析表明，除腔肠动物 Cnidaria 外， 98%的物种种内遗传距离差异为02%。然而，种内遗传差异2%的物种也逐渐被 发现22 。因此， 当利用中国动物药材 DNA 条形码数据库进 行鉴定时，只有当查询序列与参考序列比对部分的长度大于 参考序列长度的50%,且具有W 2%的遗传差异时，才给出物种水平的鉴定结果，除此之外，仅列出数据库中与查询序列 最接近序列的相关信息。此外，物种鉴定利用 BLAST 进行 鉴定，当比对部分的覆盖度小于参考序列长度的 50%

11、，且相似度 80%时， BLAST 比对结果的参考意义较小，物种鉴定 系统会提示数据库中没有与查询序列最相似的序列。 参考文献 3Yan D， Luo J Y， Han Y M ， et al. Forensic DNAbarcoding and bio-response studies of animal horn products used in traditional medicineJ. PLoS ONE ， 2013， 8（ 2）： e55854.4Luo J Y ， Yan D ， Song J Y， et al. A strategy for trademonitoring an

12、d substitution of the organs of threatened animalsJ. Sci Rep ， 2013， 3：3108.5张辉，姚辉，崔丽娜，等. 基于 COI 条形码序列的 中国药典动物药材鉴定研究 J. 世界科学技术中医药现 代化， 2013， 15（3）： 371.6崔丽娜，杜鹤，张辉，等 . 基于 COI 条形码序列的金钱白花蛇及其混伪品的 DNA 分子鉴定 J. 世界科学技中医药现代化， 2011， 13（2）： 424.7胡嵘，杜鹤，崔丽娜，等 . 海马、海龙基于 COI 条形码的 DNA 分子鉴定 J. 吉林中医药， 2012，32（ 3）：272

13、.8杜鹤，崔丽娜，张辉，等 . 鳖甲及其混伪品的 DNA429.9 崔丽娜，杜鹤，孙佳明，等 . 基于 COI 条形码序列的医药， 2012，龟甲及其混伪品的 DNA 分子鉴定 J. 吉林中32（ 2）： 176.10 崔丽娜，杜鹤，刘新成，等 . 基于 COI 条形码序列的鹿茸及其混伪品的 DNA 分子鉴定 J. 吉林中医药， 2012，COI 序列的蛤壳及其混伪品的 DNA 分子鉴定 J. 吉林中医药， 2012，32（1）：55.民卫生出版社， 2012.13Ratnasingham S ，Hebert P D. Bold ：the barcode of lifedata system（

14、http ：/www.barcodinglife.org ）J. Mol Ecol Notes ，2007， 7（ 3）： 355.14Lou S K ，Wong K L ，Li M ， et al. An integrated webmedicinal materials DNA database ： MMDBD （ medicinal materials DNA barcode database） J. BMC Genomics ，2010，11（ 1）： 402.15Edgar R C. MUSCLE ： multiple sequence alignmentwith high accu

15、racy and high throughput J. Nucleic Acids Res ，2004， 32： 1792.16Swofford D L. PAUP* ： phylogenetic analysis usingparsimony （and other methods） .4.0 betaM. Sunderland ：Sinauer associates， 2003.17Tamura K ，Stecher G，Peterson D， et al. MEGA6 ：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0J. MolBi

16、ol Evol ， 2013， 30： 2725. 18中国药典.一部S.2O1O.福州：福建科学技术出版社， 2013.学技术出版社， 2010.21Paul D N Hebert ， Sujeevan Ratnasingham， Jeremy RdeWaard. Barcoding animal life ： cytochrome coxidase subunit1 divergences among closely related speciesJ. Proc Biol Sci ，2003，270（Suppl 1）： S96.22Handfield D. A new species of

17、 Plusia （ Lepidoptera：Noctuidae） from North AmericaJ. Can Entomol ， 2006， 38： 853.Integrated DNA barcoding database for identifying Chineseanimal medicineSHI Lin-chun1 ，YAO Hui1 ，XIE Li-fang2 ，ZHU Ying-jie1 ，SONG Jing-yuan1 ， ZHANG Hui3 ，CHEN Shi-lin4*1.Institute of Medicinal Plant Development ， Chi

18、neseAcademy of Medical Sciences ，Peking Union Medical College ，Beijing 100193 ，China ；2.Information Centre ， Chinese Academy of MedicalSciences， Beijing 100730 ， China；3.Development Center of Traditional Chinese Medicineand Bioengineering ，Changchun University of Chinese Medicine ， Changchun130117，C

19、hina；4.Institute of Chinese Materia Medica ， China Academy ofChinese Medical Sciences，Beijing 100700 ， China）Abstract In order to construct an integrated DNAbarcoding database for identifying Chinese animal medicine ，the authors and their cooperators have completed a lot of researches for identifyin

20、g Chinese animal medicines using DNA barcoding technology. Sequences from GenBank have been analyzed simultaneously. Three different methods ， BLAST ，barcodinggap and Tree building ， have been used to confirm the reliabilities of barcode records in the database. The integratedDNA barcoding database

21、for identifying Chinese animal medicine has been constructed using three different parts： specimen， sequence and literature information. This database contained about 800 animal medicines and the adulterants and closely related species. Unknown specimens can be identified by pasting their sequence r

22、ecord into the window on the ID page of species identification system for traditional Chinese medicine ） . The integrated DNA barcoding database for identifying Chinese animal medicine is significantly important for animal species identification ， rare and endangered species conservation and sustainable utilization of animal resources.Key words animal medicine ；database；COI ；identificationdoi：10.4268/cjcmm20141201