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1、然而在选择AO之前必须转换图象intensity格式。校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行将光密度单位设定为ste之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。在默认的inenity格式中，是图片灰度,越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。转换光密度单位的方法如下:点击:meure-creationintnity，调出itenity校正窗口.然后在窗口中点new按纽,再点一下下面的td oical densiy选项,这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。然后还要点一下最上

2、面的sstem按纽。最后点cose关闭窗口。这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。然后就是如何能够准确地选取AO就是使用IP的关键操作一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了.在其他的测量软件中,选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画,而在IP程序里,可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。可以说,使用IP的要点就是灵活地使用各种OI工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。对不同的图片,需灵活地使用各种适当的AO工具,先用最简单的，当然，简单的工具只能作简单的事，就这张图片来说,用简单工具选黄色有点困难，我们先用它来选择蓝色的细胞核吧。

3、点击masucount/iz,弹出分类测量窗口。在窗口中选中mnual，再点击selec colo,弹出颜色选择窗口sgmentatin，这个工具是IP最有特色的颜色选取工具之一。用好这个工具是使用IPP的要点. 对于目标颜色鲜明的图片,用吸管工具是最简单的。点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色,当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域,可以在未选中的地方接着再点,这样多次选取,直到把想选中的区域全部选中为止.在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色.用红框圈起来的四个工具按纽分别是:吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。图

4、片中被标上红色的区域被定义为一个clas,其中每一个独立的小区块被定义为这个cl中的一个obct.以此图为例,图中深蓝色的部分是细胞核,因此所有的细胞核都被选中成一个lass,其中每一个细胞核就是一个bjec。选取完AI后，点击lse回到cunt/siz窗口,下一步就可以对选中的objet进行测量操作了。点击ntsze窗口中的measur菜单,点selet mese,这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项,最常用的测量有:area面积、density（an）平均光密度、iaete直径、ID（interate otcl dety）累积光密度。在相应的项目上点

5、一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了,同时关于该测量的详细说明会显示在最右边如果想取消某个已选中的测量项目,则在左边窗口中该项目上再点击一下就可以了。选好了待测量的区域，也指定了测量项目,就可以进行测量统计了,点击一下测量选择窗口的K纽,关闭这个窗口,就回到了count/se窗口，再点击一下cout按纽，就可以看到程序在进行测量,稍等几秒钟即可读取测量数据。分别点击unt/siz窗口中iew菜单中的esrement data和statistcs，就分别弹出这两个数据窗口。前者是这个calss中每一个objet的测量数据,后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等。本例中得到

6、的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值.统计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值,平均直径、累积光密度值,当然还有细胞核的数目,就是所有bjt的数目。测量数据转入XCEL处理起来最方便。只要在数据菜单中点e DD toEXCEL。数据就传到EXEL的she1里去了.在这个示例图片的统计数据中smpes为图中所有细胞核的个数。第一列为a,其中的Mean值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值.但I却是SU值更有意义 AOI技巧在IP中，最有特色，最有用处的工具有两个。一个就是我们已经看过的sgmnttio工具,另一个是ir

7、regul工具。我们先看irregula工具。这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞,为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线。这就可以用到rregur工具了.在工具栏上点一下那个不规则园形的按纽,就调出了regular工具条。这个工具的标题叫gicwand,就是phtsho中的魔棒呀将鼠标移至图中一个细胞的中间,光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域。这里相似”的定量范围由ang的值来决定。较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域。较小的range值则为较小的灰度范围。在

8、一个区域上多点几下,就能选中这个区域的整个边界了最后点一下右键,就确定了一个不规则形状的选定区域.点一下左边的问号,就能看到相应的使用说明。sooth值是用来平滑区域边界的.一般不需要平滑,因此默认值为零.选中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域（最后点一次右键）,不能直接点选,要先点击一下工具栏上的ultiple AO按纽，再点击add,接下去就可以到另一个选择区域点选。选好一个新的区域后再回去点Multiple OI-add确认，再继续下一个，直到选取完所有的I。最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。结束后如果又想再增加选择区域,只要再点一下newAOI按纽,就可以调出工具条

9、继续增加选择区域。这个rregu工具还有另一个操作方式,在问号旁边有个trce按纽，点一下它,工具条就变成另一个样子了这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹,从而画出一个沿着孤立形状边缘围成的一个AI.第一种是手画法。确认工具条右边的Auto选项没有打勾,将光标移至目标图形处按住左键拖出一个闭合图形,点右键结束.用鼠标画当然是不会准确的。实在没别的招了才会出此下策第二种方法是自动寻迹。把那个uto给选上，sped值给减到1（慢速看得清楚）,在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个寻迹的方向,马上就能看到光标自动沿着边界走起来了，一直会走到起

10、点处才会停止。这样就自动围成了一个闭合区域，点一下右键就确认了这个AO。重复选取多个AOI的方法与楼上一样。如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管用的。可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的,光标走到此处时会乱走一气这时就要及时先点一下鼠标使光标暂停下来,然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序指明一下前进的方向，如此多次,直到光标回到起点为止。最后点一下右键围成一个闭合的AOI。围好的I边界是绿色框。自动寻迹挺好玩吧?不过别忘了我们的目的.选好了一个个的AOI后当然是要测量每个区域的几何尺寸及光密度啦.下面该怎么作呢？点开countsie窗口，点菜单EDIT-onvrt AI to Ojc

11、。这样就把刚才选中的一个个O变成了要测量的obj了,那些小区域的颜色也由AO绿色外框线变成了ojct的标记了。objt的标记类型是可以自己设定的。在contsize窗口右边有一个otion按纽，点开它就能设定oject标记的外观了。在opon窗口中,utliestye可以选outline（轮廓线）或ille（填充class颜色）。lb style 可以选择为oject序号或测量值。再下面是abl的文字颜色。右上角还有一个class的颜色选择按纽。下一步是点meaue菜单下的selec measremnts。选上要测量的项目。注意,选完后要点击这个菜单中的measue按纽（而不是cuntse窗口

12、中的count按纽）。然后是OK按纽关闭asure窗口,点开ie菜单下的mearement dte和tatistics数据窗口.几个obe的测量数据就已经在里面了。如果你还想继续增加obcet,可以直接用irregua工具画,然后点convrt AOI to object。这期间把数据窗口留着不关闭，可以看到新增的obje测量数据会立即被更新。在上一主题中讨论 的主要是irreglar工具,它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的.而面对组织切片中密密麻麻的细胞,就得用本主题讨论的emetain工具了。实际上,在第一部分入门中所用的就是segmetaion工具,在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色

13、的细胞核,但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现,有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个,另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核。如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域,就会发现因为黄色很浅,很不容易准确地选取。所以对于sgenain工具还需要有更多的应用技巧。让我们还是从打开图片并调出coun/sie窗口开始吧。对这种色彩饱和度低,各种成分颜色区别很小的图片来说，用吸管是很难准确选择到正确的颜色区域的。在ctie窗口里选中anl,并点selct col调出segmnttin窗口。窗口里有两个表单,一个是ooruesed，另一个是hsoram bed。如果你测量的

14、对象颜色单一，色彩对比大,则使用olr ue baed中的吸管就可以方便地选择到需测量的区域。而对于那些有颜色深浅及亮度不同的测量区域,我们要选取后者,并且使用I颜色格式来进行分色选择。当切换到HSI时,会弹出一个窗口提示你会set颜色选择，是否继续？当然是OK啦。这时的颜色选择全部重置为-55。在HSI颜色格式中，H为色调,就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S为色饱和度，I为强度。在选择AOI时，首先保持S、I为最大范围,从H中选择黄色部分。使用这个颜色格式的好处是，选择的颜色能包括这种颜色的不同深浅及亮度最适合于测量免疫组化图片。点一下H,直方图显示就是图片各象素H值的分布，在直方图的

15、两边各有一根线，这就是选择线,先将右边的线用鼠标左键向里面拉,拉一点停一下看看效果，可以看到最开始时是选中了全部画面，然后是蓝色的区域慢慢显露出来,并且越显越多,选择线的位置也在下面的窗口中有显示,是0-5之间的数,共有两个窗口，左边是取值下限，右边是取值上限,先不断减小上限值使得非黄色区域不断地显露出来,再不断增加下限值让另一部分非黄色的区域也显露出来。这张照片中黄色区域为H：03.色饱和度S与强度I都直接设为0-255。这就是说,只要是黄色,就被认为是阳性表达的区域。选好了颜色范围,点cse关闭mentato窗口,回到count/si窗口,点meur的ele measuremnt ,选中a

16、ra， dnity（ean）,IOD坏事了,这个窗口的measu按纽是灰色的,不能用。回到cut/se窗口，按ont纽,也一样不好用！!！或者点c后计算的区域根本就不是刚才选取的正确区域.这是使用HSI选色时最常犯的错误:只是操作顺序不对。正确的操作顺序是:先打开lec arment，选择好各个测量项目,再回到count/siz中点slect cor进行颜色选取,再回到cout/size窗口中点cnt计数。这样操作结束后仔细观察一下计算的区域，正是刚才正确选取的区域了。这样选取的区域还是有一点不准确。图片中被选中的区域有许多很小的选点，显然这是各种杂质,并不是成片的蛋白表达区域对这些杂质小点有

17、一个有效的方法来去除，就是测量过滤（filt）。打开sect meuent窗口，点一下中间被选中测量项目中的r项,使其加亮。这时下面的star与en选项就变黑可调了.对are来说,默认值一般是0,意思是不管区域有多小，都被计入测量范围内.现在我们把它改为50,也就是说，忽略了象素点小于0的杂质点,不予计算在内。改完后点一下旁边的er按纽,再点measue按纽。或者回到count/size窗口内把Appl Fler nei ang前面的选项给勾上,再点cou按纽。这回就把小杂质点全给过滤掉了.过滤是一种很有效的选取AI的手段，除了定义面积范围进行过滤以外，还可以选取BOX XY测量项目,这是oj

18、et外切长方形的长宽比，如果是圆形的obect，这个值应该是1，在作园形的细胞计数统计时，把这个值的范围设定在0.5到0之间,就可以滤掉长条形的杂质Obje，当然同时也可以设面积过滤范围。把那些通过颜色选择不能排除的ct给进一步排除掉。类似的测量选项还有Radiustio等,通过这些测量值的过滤,可使得A选得更加准确显微镜图象千差万别,每一次进行分析都需根据具体的图像情况来选择AO方法。前面所述的各种技巧需交替应用。凡是玩电脑都必会有一个rest键。不管作错了什么事，按一下rst键就可以全部重新来选O也是这样,如果选得不合心意，想全部重新来的话,按untsz窗口中的delete键，就可以把刚才

19、作的一切都给全部推倒重来了。另外还有一个是反向选择。在选文件夹与word的eit菜单里都有这项功能.segntato里也有这个哟。在前面的图象里，选好颜色后,点一下用红圈标注的那个按纽,就实现了反向选择。关于segnatin窗口中其他一些按纽的用处，大家可以从帮助文件中查找。尽管帮助文件是英文的，看起来有点困难,但中文的帮助文件翻译得不准确，有时比英文的还难懂呢总结一下emntaon工具的用法,有两种，一种是在color c base模式中用颜色吸管来选取目标颜色（区别明显的图片）.另一种是在istogram Bad 模式中利用HSI范围来选取目标颜色（免疫组化差别不明显的图片）。二种方法各有

20、其优点，其共同之处就是把图片中相同颜色的区域给定义成一个clss,以便对它们进行分析处理。在egmtation窗口的下方还有一些有用的功能.在rvie框中,上面一个选项是对选择的区域标注ckss颜色的，可以选择不标色,只标当前class颜色（crrentclass）或者所有clas颜色下面一个选项则是对选中区域与非选中区域分别标上不同颜色的选择,我一般选择classcolron transpaent。这样在选择颜色时能观察尚未被选中的部分。如果把一部分选成blac,其效果就等于把这一部分从图象中抠去,这个处理也是很有用的。标注上了clss颜色的图象可以点rearie iage按纽来另存成一个新

21、图片,窗口最下方的l按纽是用来保存颜色选取参数的.这个颜色参数文件非常有用。在处理一组多个图片的时候,不能每个图片都选择一次颜色,这样各个图片的选择标准不一致，而且费时间。先处理一张典型的图片,把颜色选择参数保存成一个文件，在处理下一张图片时，只要把这个文件再调出来就行了.这个操作在使用宏操作时是必须的。segmntation 工具与regulr工具在counsiz中可以灵活应用.。单独使用iregular工具画一个或几个孤立区域,只测量它们几个的各种参数。2。单独使用segeation工具，对颜色对比明显的区域可简单使用吸管选色,对颜色不明显的图片用HS格式来选择同样色调的区域。3.同时使用

22、irrlar与segenation工具，前者可以限制图片上的一个测量范围，后者则选择了这个范围内的特定颜色区域具体作法请看下面几楼sper270的跟帖这可是高级的IPP技术呀。相比之下，实际上我讲的都是基本的,初级的使用方法。在选色窗口中还有一个lass1的下拉对话框,就是说，我们可以分别选择两种以上颜色，然后同时计算它们的各种参数。例如,我们可以先选择蓝色的细胞核并给它们标上紫色的标记色,再新建一个a,选择黄色的免疫组化染色区域,并给它们标上红色。有时候我们会不得不使用这个技术:有的照片照得偏蓝色。这样在使用segmtaon选择黄色的区域时会发现，一部分黄色的值在-30，而另一部分黄色区域的

23、HSI值却在0-25之间。这时就不得不分别选择两个clss,分别计算其IOD及ara之后再把它们相加起来。这大概也算是高级一点的技术吧 为什么按照陈老师的帖子，我用HSI处理的图片结果是:要表达的阳性部位都没有被“染”上红色,反而不想要的背景都全部变成红色了？呵呵,瞧你选的H的范围,是1625。应该选016才对呀。也就是说,左边那根线应该留在最左边的位,把右边那根线向左边拖。我以前也不敢轻易使用宏，但是处理过大批量的数据之后才发现，宏是非用不可的工具，而且编制宏并不难。实际上宏不过是把一连串的操作集合到一个操作的有效工具。例如:一大批图片,需要把它们的象素调整到一个较小的值以便上传到网上。一大

24、批图片，对每张图片进行一个扣背景的操作.。这些简单的操作虽然只需点几下鼠标，但乘以10就费事了,作一个宏操作,处理每张图片只需按一次快捷键，就省事多了,还不容易出错。对于分析免疫组化图片这样的复杂操作,制作一个宏来进行分析,节省下来的时间就更可观了。首先是在所有待处理照片中挑选一张有代表性的典型图片，进行仔细的选色及分析测量。得到满意的结果后,就可以按照这个既定的操作程式进行宏的编制了。以下面的免疫组化照片的分析测量为例。处理顺序是:打开图片后1。点开countsi窗口，点measuselect measurent 菜单，选择Ara、densit（mean）及IOD三个测量项目,不使用测量过滤

25、clssobjct 标记为标记class颜色,2。选择图片中黄色区域作为蛋白表达区,组织空白区域较亮的地方为背景区域。经试验这两个区域都用HS分色选取比较准确。蛋白表达区的HS分色数值为H:02,S与都是05。背景区的S分色数值为H：52-140,S:-255,I:173-255。3。先测量蛋白表达区。选完分色后点unt，在statstics窗口中把统计数值传入Excl中。4.再回到egmenaon中选背景区的分色，再次cou，把统计数值传入Eel。测量结束时在Ecl中有两组统计数值。在编制宏操作时，因为是自动操作,所以不能有人工选择干预的操作动作因此要对上面的操作顺序进行一些适用于宏操作的调

26、整.宏操作前的准备：1。把count/size窗口中各项选择设置完成后，包括eect mesureet、css opion设置，点击ile菜单的sae settings 将这些设置保存成一个文件,保存位置最好放在与待处理图片一起的文件夹中。并起一个有意义的文件名,但最好是英文。2.再把smetaon窗口打开,选好阳性表达区域的分色后，点击下面fle中的sae il，把这个分色设定也保存成一个文件,也起一个有意义的英文文件名。存完后重新选择背景的分色,再把背景分色设定也保存成一个文件。打开stis窗口,如果打不开的话可先点一下count随便测量个数值。然后点一下ile菜单中的DE pton窗口。

27、设置一下测量数据传往xce的规则,这很重要.如果设置不当，你会不知道传过去的数值跑哪里去了。在DDEoption窗口中从上到下需要填的选择是:ta prg:xcel 这是废话,不必改。就这样了。path:。.。.。也别改。里面是xcel程序的文件位置,好长呢,别动它。shet:Active shet。 这是说数据将存到Excel中活动表单中了,还有一个选择是填sheet 1。这样统计数值每次都会存到第一页里。otion data setrow1l 1 这是指定数据从Exce表单的具体哪个位置开始放,现在的行列值都是一,就是左上角。在测量过数据后，这个行列值会自动地按下面选项的规则递增.如果想让

28、数据重新从左上角开始填，那就必须把这个行列值给改回1。再下面是三个单选项:apen ex ate set th btt 下一组数据放在前一级数据的底下。pendn e eto e ight 下一组数据放在前一级数据的右边。imcremnt postionor naxtdateset yrow _ co _这个更灵活,只要填上几行几列，下一组数据就移动几行几列存放。如果行列值都填为,那么每次都会存在同一个地方。后面的数据会覆盖前面的数据.设定了DEoption后，不要关闭satstics窗口。让它留在那这样DD的设定就不会悄悄地变化了。作好上面的准备工作，就可以正式录制宏了。.打开一张图片，打开nt/sie窗口，还有空着的statitic窗口。点Macro-ecord Mcr,就调出来了录制宏的开始窗口。要填上