08细胞生物学精简版北京协和医学院Word文档下载推荐.docx

1、基因调节：精子发生特异基因；精子发生相关基因1、精子发生特异基因（1）. 编码的蛋白在精子发育过程中行使不可缺少的功能（2）. 表达具有阶段特异性（3）. 只在生精细胞中表达，或转录生精细胞特异的mRNA有3类特异基因：Homologous genes；Unique genes；Genes expressing unique transcripts1 Homologous genes（同源基因）:只在生精细胞中表达，但与体细胞中的基因密切相关，它们通常是基因家族的成员。2 Unique genes（特有基因）: 编码生精细胞蛋白，这些蛋白与别的细胞表达的蛋白没有显著相似性。3 Genes ex

2、pressing unique transcripts（表达特定转录物的基因）：表达生精细胞特异转录物，这些转录物与体细胞中的不同。2、精子发生相关基因：在Sertoli, Leydig和spermatogenic cells特异表达的基因3、基因表达的调节：包括3个水平的调节：transcription, translation and post-translation1 与其它细胞一样，转录调节是基因表达的初始的决定性调节；2 而翻译调节在生殖细胞中所发挥的作用要比其它细胞中大，尤其是在减数分裂后阶段的蛋白合成；3 通过蛋白修饰进行翻译后调节影响精子发生的转录和翻译。四、精子发生相关基因1

3、. Proto-oncogene：c-Kit，spermatogonium spermatocyte.2. Meiosis related genes：ott，expressed in meiosis3. Cell cycle genes：cdc25; Cyclin A1, A2; cdk1, cdk2。4. Cytoskeleton：actin； tubulin.5. Temperature sensitive genes：HSP70-2; TRS1; TRS2; TRS3。五、基因表达谱基因的特异性表达我们体内大多细胞含有相同基因并不是所有基因在每一个细胞都表达当需要时一些基因才表达许多基

4、因表达为某一类细胞所特有（如肝细胞表达解毒酶，胰细胞表达胰岛素）为了了解细胞是如何产生表达特异性的，要确定每类细胞的所表达的基因研究基因表达的方法RT-PCR、Northern Blot、RNase保护实验、基因芯片（同时可分析大量的基因表达）Atlas Arrays操作步骤Tissue 1RNA Sample 1Probe 1 Tissue 2RNA Sample 2Probe 2两者比照分析找出表达差异基因。芯片分析结果要采用其它基因表达分析方法（如Northern Blotting or RT-PCR）进行佐证。二、基因转移与RNA干扰（韩代书）一、基因转移（gene transfer）

5、基因转移是通过不同途径把外源基因转移到宿主细胞中，并得以表达的过程。其目的是研究基因的表达调控及其功能。包括转染（transfection）、转化（transformation）、感染（infection）。转染：把外源基因转移到真核细胞中，主要指哺乳动物细胞。转化：把外源基因转移到原核细胞中的过程，指细菌中。感染：用病毒做载体进行的基因转移。基因转移两个主要因素：受体细胞：接受外源基因的细胞。基因载体（运输工具）：携带目的基因并运送至细胞内。受体细胞应满足以下条件：1. 细胞本身并不表达要转染的基因，否则无法区分内源和外源基因。2. 基因的细胞特异性表达：一些基因需要合适的细胞系才能表达，它

6、们可以在一些细胞中被诱导表达，在另一些细胞中不能被诱导表达。3. 选择容易被转染的细胞：容易培养、生长速度快的细胞容易被转染, 成纤维细胞比上皮细胞容易被转染。4. 两种常用细胞系： COS细胞: 用SV-40基因组转化猴的CV-1细胞 CHO细胞: 中国地鼠卵巢的成纤维细胞基因载体载体的功能： 1. 为了外源基因的表达：克隆的基因多数为cDNA，缺乏表达所必需的调控元件,需要重组到带有这些调控元件的载体上才能有效的表达。 2.为了更有效的进入细胞：载体容易进入细胞。理想的载体： （1）可以高水平的表达目的基因 （2）可以高效的转移到细胞内 （3）具有高度的安全性（特别是基因治疗）载体可以分为

7、两大类：病毒载体（viral vector）；非病毒载体（non-viral vector）1、非病毒载体-质粒，是环状双链DNA，具有酶切位点，可分为：非表达载体（克隆载体）: 不含有表达元件, 只用于基因的保存、扩增、序列分析 表达载体: 含有表达元件，分为真核细胞表达载体和原核细胞表达载体2、病毒载体：由于病毒的结构和生物学特性，如感染细胞、可把外源基因重组到病毒内、通过感染细胞把外源基因转到细胞内。可分为逆转录病毒（RNA病毒）、腺病毒（DNA病毒）、腺相关病毒。1） 逆转录病毒：优点：（1）感染效率高，有时可高达100%（2）可整合到宿主基因组中，稳定表达。缺点：（1）只感染并整合到

8、分裂细胞（2）随机整合，可能干扰宿主的基因，从而引起疾病。2） 腺病毒：（1）可以携带大量的外源基因，感染及表达效率高。（2）基因不整合到属主细胞的基因组中，不会引起疾病，但只能瞬间表达。（3）易受免疫系统的攻击。 3） 腺相关病毒：感染效率高；携带的基因较少（4.5kb）；可以整合到基因组中。基因转移的方法以质粒为载体的基因转移方法1. DNA-磷酸钙沉淀法：Ca2+、PO4- 和DNA 形成 沉淀颗粒，可以沉附于细胞的表面, 通过内吞作用摄取DNA。适用于贴壁和悬浮培养的细胞。2. 脂质体介导的基因转移：脂质体+DNA 复合体，DNA被包围在复合体内，通过与细胞的融合或内吞进入细胞。3.

9、电转移：细胞在短暂、高压地电脉冲的作用下，表面可形成微孔，改变细胞的通透性，DNA可直接进入细胞。4. 微量注射：直接把DNA注射到细胞质或细胞核中。可有效的把基因注射到受精卵的原核中，制造转基因动物。基因在宿主细胞中的表达：瞬间表达和稳定表达 瞬间表达：外源DNA进入宿主细胞后, 可在胞质中表达一段时间, 随着细胞的分裂传代而丢失。 稳定表达：只有在少数被转染的细胞中, DNA整合到宿主基因组中并可遗传给后代, 得以稳定表达, 这类细胞称之为稳定转染子。二、RNA 干扰：RNA 干扰是双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）引起的序列特异性的基因沉默。转录后基因沉默

10、。当把一段与特定基因mRNA的序列相同的dsRNA导入细胞后，mRNA被dsRNA识别，并被降解。是真核生物中一种普遍存在的基因调控机制。RNAi机制：三步Initiation、Effector、Amplification1. Initiation step：进入的dsRNA被消化为21-23个核苷的小干扰RNAs （siRNAs），也称为guide RNAs2. Effector step：siRNA duplexes结合核酸酶复合物形成RNA诱导沉默复合物（ RISC）；ATP依赖性的siRNA duplex解螺旋激活RISC；活化的RISC通过碱基配对作用与同源转录物结合并从siRNA的

11、3末端切掉mRNA 12个核苷。3. Amplification：通过复制进入的dsRNAs产生更多的siRNAs进行扩增；也能在RdRP作用下通过siRNAs的复制扩增。RNAi中的复合物1、RNase III proteins2、the RNA-induced silencing complex （RISC）3、The dsRNA-dependent DNA methylation （RdDM） complex4、The RNA-dependent RNA polymerase （RdRP） complexmiRNA与siRNA短RNA发夹miRNA（内源性编码非编码小RNAs），与靶序列

12、部分互补，抑制mRNAs 翻译长dsRNAssiRNA（外源性），与靶序列完全互补，降解mRNAs siRNA的5端可发生突变，但3端不易突变siRNA的反义单链和siRNA duplex效应相似miRNAs 和siRNAs能采用相似的机制抑制mRNA的表达RISC的作用可能依赖于guide RNA和靶序列的互补程度RNAi的应用：Basic Research、Clinical PerspectiveRNAi 的技术要点：siRNA的设计；siRNA的合成；siRNA导入细胞的方法siRNA的设计长链dsRNA沉默靶基因的特异性差，21bp的短dsRNA特异性及效率最好。siRNA序列设计规律

13、： 1.从AUG开始向下游找AA序列,将AA后的19个核苷酸为siRNA序列. 2.每个基因选3-4个siRNA序列,选出特异性最好的siRNA. 3.避免3和5端非翻译区、起始密码附近.siRNA的合成1） 化学合成2） RNase III消化dsRNA3） 体外转录4） PCR Expression Cassette5） siRNA表达载体，如pSilence 1.0-U6siRNA导入细胞的方法1） dsRNA注入胚胎；建立表达dsRNA发夹的转基因果蝇；在含有dsRNA的基质上直接培养2） 人工培养的哺乳动物细胞：将dsRNA转染或注入胚胎培养细胞或卵母细胞或早期胚胎分化了的细胞或整个

14、器官（体内）：用合成的siRNA转染；转染表达miRNA前体样颈环的质粒的细胞产生siRNA三、细胞凋亡与自噬（郑德先）要点： 基本概念（凋亡、自噬、坏死） 细胞凋亡的基本特征（与坏死的区别） caspase家族一、基本概念（凋亡、自噬、坏死）细胞凋亡：是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。也称为细胞编程性死亡。细胞坏死：是极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡。细胞自噬，是一种在真核细胞中相当常见的现象，能够藉由与溶酶体结合，代谢细胞质中的大分子与胞器。自噬作用是细胞加速新陈代谢，或者在饥饿时获得能量的一个重要手段。细胞自噬除了能使细胞存活之外，许多研究发现其在细胞死

15、亡的过程中扮演了重要的角色。当肿瘤细胞里受到化疗和放射线治疗时，会开始细胞自噬的过程，但是目前还不知道这会导致肿瘤细胞死亡，或是帮助肿瘤细胞在抗癌疗法中存活下来。二、细胞凋亡与坏死的区别两者的主要区别是：细胞凋亡过程中，细胞膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多凋亡小体，凋亡小体则为临近细胞吞噬，整个过程中，细胞膜的整合性保持良好，不引发炎症反应；在细胞坏死时，细胞膜发生渗漏，细胞内容物释放到胞外，导致炎症反应。1、形态学特征：细胞凋亡：单个细胞丢失、细胞膜发泡，但膜完整、染色质浓缩、细胞皱缩形成凋亡小体、不引起炎症反应、被正常和巨噬细胞吞噬、溶酶体完整、线粒体膜通透性改

16、变、浆膜发泡、不对称、染色质均一浓缩细胞坏死：成群细胞死亡、细胞膜破裂，不完整、细胞膨胀而溶解、引起严重炎症反应、被巨噬细胞吞噬、溶酶体破裂、染色质聚集成块，不均一2、生化特征：生理因素诱导、生物合成调节、需要能量、需要大分子合成、有新的基因转录、Caspase 依赖性、DNA非随机性降解为0-300kb和180-200bp的整数倍的DNA Ladder、磷脂酰丝氨酸外翻非生理的意外性死亡、离子稳态调节丧失、不需要能量、不需要大分子合成、无新的基因转录、DNA随机性降解成为任意长度的片段3、细胞凋亡的生理学特征：保证个体正常发育：蝌蚪成蛙、昆虫蜕变、淋巴细胞阳性和阴性选择等；维持正常生理过程：

17、CTL杀伤靶细胞、表皮和指（趾）甲的形成等；细胞凋亡的可诱导性与可抑制性：治愈肿瘤、爱滋病等细胞凋亡失常疾病。三、Caspase家族1、Caspase是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，他们的一个重要共同特点是特异的断开天冬氨酸残基后的肽键，caspase能够高选择性的切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数位点上，从而活化某种蛋白或使某种蛋白失活。2、Caspases的结构包括prodomain（相互作用）和caspase domain（蛋白水解，水解天门冬氨酸的羧基端）3、Caspases的功能：caspase1和caspases5/11：细胞因子成熟casp4和c

18、asp12：内质网应急凋亡，炎症casp2，casp8，casp9，casp10：凋亡起始casp3，casp6，casp7：凋亡执行4、Caspase激活机制：上游的caspase激活下游的caspases;诱导邻近效应，低浓度的pro-caspase聚集后，产生蛋白酶活性；与调节亚基结合，如caspase-9与Cyt C,caspase-9与Apaf-1形成复合物，使caspase-9激活。四、细胞生物学研究方法与技术（赵方萄）1、 光镜：重要参数的意义，不同种类及应用2、 电镜：常用种类、应用3、 常用的细胞分离方法及使用：离心、流式、磁珠4、 离心机：RCF、使用注意5、 共焦显微镜、

19、流式细胞仪分别用于什么实验？有什么区别？6、 做好流式实验的三个要求是什么？7、 流式的常用图形及大概意义。8、 了解各设备的应用目的一、光镜：参数：数值孔径（NA）：物镜框口能够纳进的光通量大小，NA越大，成像越清晰，镜头越好。由于NA = hsina/2，其中物镜的框口孔径角无法改变，所以数值孔径只与介质折射率有关，与介质折射率成正比分辨率：分辨最短距离的两个质点的距离（d）。与入射波长成正比，与数值孔径成反比。放大率、焦深、覆盖差、工作距离、视场直径等等。A-PLAN：矫正像差、色差能力；光镜的不同种类及应用：1、几何光学显微镜：透射光显微镜。正置：死细胞、染色；倒置：针对活细胞；2、物

20、理光学显微镜：相差显微镜、微分干涉、DIC。针对活细胞、不染色，提高了标本细节折光率；3、信息转换显微镜：荧光显微镜-可以用于标记靶分子、限定入射光波长、提高分辨率、标记活细胞。激光扫描共聚焦显微镜-照明点探测点共轭、光切片、共聚焦提高了分辨率。定量、定性、分子间相关性。常用显微镜对比：透射光相差/DIC荧光标本死细胞 染色活细胞 不染色 活/死细胞，需荧光染色用途细胞组化看形态,运动靶分子定位 定量原理特点强度亮度差相差振幅差短波光源 高分辨率物镜Ph标记/DIC专用NA值高二、电镜：1、扫描电镜：利用“背散射电子”“二次电子”成像，用于观察细胞表面的结构。扫描电子显微镜用来观察标本的表面结

21、构。常用的方法有一般扫描冷冻断裂和冷冻蚀刻，可以用来观察断面的表面结构。2、透射电镜：利用偏离原入射方向的“散射电子”、或者“衍射电子”成像。目前TEM的分辨力可达0.2nm。一般用于观察内部结构，常用的技术有超薄切片技术（用于观察亚细胞结构观察）和负染色技术（病毒、蛋白结构）三、常用的细胞分离方法及使用：1、不同的细胞采用不同的分离方法：细胞群分离：离心/流式/磁珠单个细胞群分离：显微激光切割术细胞器/可溶性大分子分离：超速离心常速低速离心机常用于细胞、细胞核的分离；高速离心机常用于细胞、细胞器的分离；超速离心机用于细胞器，病毒，核酸，核糖体，蛋白质的分离分析。常用的离心方法1）. 差速离心

22、法（分步离心）2）. 密度梯度离心法（区带离心）（1）速率区带离心（2）等密度区带离心 3）. 分析离心法2、离心、流式、磁珠（一）离心分离：密度梯度离心（Ficoll, Percoll），例：全血中分离白细胞。效果不精密。（二）流式细胞仪：是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，是多参数分选，与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术，可以同时进行4色分选。可以用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的

23、识别和爱滋病感染者T4、T8细胞的记数。目的:识别混合细胞中含有某些特性的亚细胞群。原理:用荧光标记靶分子，通过对每个微粒的鉴定，得到统计学数据（提供细胞群体的均值和分布情况） 应用：对混合细胞中的靶细胞做定性、定量、分选。（三）磁珠分选术：用于单参数的分选，方法简单，消毒方便，在应用于多参数分选的时候步骤繁复。一般磁珠可以分为三种规格，有大中小三种，其中小磁珠技术可以分选CD8+T细胞，一般流程为先用小磁珠做磁性标记，通过分选后未标记的细胞先流出来，然后通过洗脱，阳性分选的细胞洗脱出来。四、离心机：RCF （简称g值）：相对离心力场 （RCF）= 离心力场/重力场离心力场 a= 旋转角速度2

24、离心半径= w2r离心力场：描述离心力场的强度,用离心加速度的大小来表示。RCF的物理意义：该转头所产生的最大离心力场 是重力场的多少倍。使用注意：一般注意：配平；转速最高极限；平稳运转后离开；清洁超速离心注意：离心管，封管确实（免抽干）；转头，安装稳妥；转 速，旧转子需打折转速； 检查，不可有任何伤痕五、共焦显微镜、流式细胞仪分别用于什么实验？共焦显微镜：显微镜水平对单个细胞内靶分子的研究。如：靶蛋白定位、定性、定量分析。 并可扩展研究分子间相互关系、分子动态分析、三维成像等等。流式细胞仪：目的：识别一群微粒中含有某些特性的微粒（亚细胞群、特定颗粒）。 原理：用荧光标记靶分子，通过对每个微粒

25、的鉴定，得到统计学数据（提供细 胞群体的均值和分布情况）。 应用：对一群靶细胞做定性、定量、分选六、做好流式实验的三个要求是什么？1、设计合理、理解目的；2、理解图形意义；3、做好样品（对照）；七、流式的常用图形及大概意义。流式常用的图形有：1. 单参数图：用于单染：细胞周期实验、某分子单独标记，直方图可直观单个参数的细胞数量，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。2. 双参数（点图、等高图、密度图）：二维点图，双坐标均为荧光强度3. 三参数图八、了解各设备的应用目的1. ELISPOT：检测细胞分泌功能2. 活细胞工作站：持续观察靶细胞，获得一段时间内细胞各种活动过程的记录，可做多维分子水平的观

26、察3. 活体成像仪：整体水平观察五、抗体制备及应用（陈实平） 单抗与多抗的区别 免疫动物的基本方法 纯化抗体的各种方法 （原理，纯化效果，特点等）一、单抗与多抗的区别：1、 单克隆抗体的特点单克隆抗体（Monoclonal Antibody,McAb）：单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体（1）特异性强，具有抗原结合位点的专一性。（不是抗原的专一性！）；（2）因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应；（3）抗体的性质相同，容易纯化、标记；（4）单克隆抗体有交叉反应是由于它所针对的抗原结合位点在其他抗原上也有,结构完全相同（100%的交叉反应）,或相似（不同

27、程度的交叉反应）。2、多克隆抗体的特点：多抗是单抗的混合物，由多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体因此多抗的性质是一个群体综合的性质。（1）特异性一般比单抗差：因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。（2）比单抗更容易捕捉抗原：因为含有抗不同表位的抗体，多种抗体都可与抗原结合。（3）抗体的纯化、标记比单抗难：因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清中含有的杂蛋白比较多。单抗与多抗的区别 单抗 多抗抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质纯化标记 容易，效果好 难度高一些 种属来源 绝大多数是小鼠

28、兔子、羊、豚鼠等制备周期 长 （最短4个月） 短（2个月）制备技术 复杂 简单经费 多 少 二、免疫动物的基本方法1） 免疫的基本步骤基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐剂（含矿物油,卡介苗等）.加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用佛式不完全佐剂（含矿物油,不含卡介苗）.取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。放血制备血清：最后一次免疫后7-10天放血。 （在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存）2） 如何免疫兔子2000g（雌雄均可）,健康,无病原基础免疫：0.5ml抗原（含0.250.5mg蛋白或108颗粒抗原）0.5ml佛式完全佐剂（CFA）