微生物发酵工艺Word文件下载.docx

1、 概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质 作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。 种类：盐离子磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。4、水菌体细胞的主要成分。营养传递的介质。 良好导体，调节细胞生长环境温度。 培养基的主要成分之一。5、生长因子（growth factor）维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。种类：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸 等。 天然成分中含有：一般无需添加。 营养缺陷型菌株：必需添加。6、前体（precursor）加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到 目标产物分子中，而自身的结构无多

2、大的变化。 使用： 添加前体是提高抗生素产量的重要措施。多次少量流加的工艺。6、促进剂（accelerant）概念：促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体 的一类化合物。种类：氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物等，起诱导作用。7、消沫剂（defoamingagent） 降低泡沫的液膜强度和表面黏度，使泡沫破裂的化 合物。 种类：表面活性剂，低表面张力。 天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸 和酯类、聚醚类、硅酮类）。 作用： 消除泡沫，防止逃液和染菌。6.4.2 培养基种类及其质量控制技术培养基的种类按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基等

3、 按物理性质：固体，半固体、液体培养基按化学组成：合成、半合成、天然培养基按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板固体、种子、发酵和补料培养基。1、固体培养基（solid medium）细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝 状真菌的孢子培养基。 制备：液体培养基添加1.0-2.0%琼脂粉。 作用：提供菌体的生长繁殖，形成孢子。1、固体培养基要求与质量 控制单细胞培养基：营养丰富，满足菌体生长迅速，不 能引起变异。 孢子培养基：基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。2、种子培养基（seed medium） 供孢子发芽和菌体 生长繁殖，摇瓶和种子罐培

4、养基,为液体。使种子扩大培养， 增加细胞数目， 生长形成强壮、 健康和高活性的 种子。2、种子培养基 要求与质量控制用速效性、容易被利用的碳、培养 基成 分必 需完全， 营养 丰富。 氮源和无机盐等物质，但浓度不宜高。种子培养基要与发酵培养基相 适应，主要成分接近，不能差 异太大。缩短 发酵 的延 滞期。3、发酵培养基（fermentatio n medium） 提供微生物 生长、目标产物生成的生产用培养 基。 不仅要满足 菌体的生长 和繁殖，还 要满足菌体 合成目标产 物，是发酵 生产中最关 键和最重要 的培养基。要求 营养物质浓度和 粘度适中组成上丰富完整不同菌种和不同 产物，对培养基的要

5、求差异很大，组成和配方需要 优化4、补料培养基（fed medium）发酵过程中添加补充的培养基。稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标 产物产量 组成：各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体制备：按单一成分配制，各自独立控制，或按一定比例制成复合补料培养基。5、控制发酵培养基质量（1）控制水质：恒定水源和恒定的水质。 地下深层井水，对水质定期化验检查，使用符合要 求的水质配制各种培养基措施：检测与控制水质参数pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、各种矿物， 特别是重金属的种类和含量。（2）控制培养基原料的质量：来源与种类的选择 农产副品：因品种、产地、加工、贮存条件不同 而质量差异较大。化学原料：

6、杂质含量也不相同。保持稳定的原料来源。 更换原料时，必需再进行一系列试验，确保产量 和质量的控制和稳定性。原料的选择试验：不同碳源、氮源对菌种生长的能力和产物的生产能力 很不相同。 对原料进行试验，选择满足发酵要求的来源。注意： 碳氮浓度与配比：适宜 速效和缓效成分相互配合，发挥综合优势pH：配制时加入酸碱性物质搭配，甚至使用缓剂。（3）控制培养基的黏度：对发酵的影响： 高黏度的培养基，不易彻底灭菌 影响发酵的通气搅拌等物理过程 直接影响菌体对营养的利用 目标产物的分离提取造成困难固体不溶性成分，淀粉、黄豆粉等增加培 养基的黏度，酶水解，降低大分子物质（4）控制灭菌操作：高压蒸气灭菌影响培养基

7、的有效成分甚至是活性。 较高温度下长时间灭菌，营养成分会破坏，甚至产 生有毒物质。 磷酸盐与碳酸钙、镁盐、铵盐也能反应，生成沉淀 或络合物，降低利用度。 维生素等不耐高温分解破坏、失活。6.4.3 制药生产用培养基的配制一般设计原则设计思路 计算与定量配制 优化1、培养基设计一般原则 生物学原则：根据不同微生物营养和反应需 求设计。 营养物质组成：较丰富，浓度适当。 成分之间比例：恰当，C/N比适宜，有机和无 机氮 原料之间：不能产生化学反应。适宜的pH和渗 透压 工艺原则：不影响通气搅拌、分离精制和废 物处理，过程容易控制。 低成本原则：原料来源方便，质量稳定，质 优价廉。 高效经济原则：满

8、足菌体生长和合成产物的 需求，最高得率，最小副产物。2、培养基设计基本思路起始培养基：根据他人的经验和使用。 单因素实验：确定最适宜的培养基成分。 多因素实验：各成分之间最佳配比和浓度优化。 中试放大试验：摇瓶、小型发酵罐，到中试，最 后放大到生产罐。 综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确 定一个适宜的生产配方。3、理论计算与定量配制微生物生长和生产可用下列表达式表示：碳源和能源氮源其他营养物质细胞产物CO2H2O热量单位细胞生物量所需最小的营养物质: 单位产量的最小底物浓度:碳源和氮源进行转化率计算和分析初步计算：参考微生物的化学和元素组成。转化率：单位质量原料生产的产物量或细胞量。理

9、论转化率：根据代谢途径的物料衡算实际转化率：发酵过程中实际测量数值计算。 目标：使实际转化率靠近理论转化率。无法从生化反应原理来推断和计算出最佳培养 基配方 根据生理学和生物化学理论 参照前人所用的经验培养基结合菌的特殊生物学和产品特征要求进行大量细致和周密的试验研究小结培养基组成与作用：C、N、无机盐、水、生长因子、前体与促进剂、消泡剂培养基制备与质量控制：固体、种子、发酵培养 基 生产用培养基制备：原则、思路、优化思考题（1）培养基组成成分有哪些，有何作用？ （2）固体培养基、种子培养基、发酵培养基的 组成特点及其如何衔接？ （3）如何研制生产用培养基？ 第六章微生物发酵制药工艺6.3 制

10、药微生物生产菌种建立6.4 培养基制备6.5 灭菌工艺灭菌方法与原理培养基灭菌工艺空气除菌工艺几个概念 杂菌：除生产菌以外的任何微生物。 污染：感染杂菌的培养或发酵体系。消毒：杀灭或清除病原微生物，达到无害化程度，杀灭率99.9%以上。杀菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微生物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。 灭菌：微生物杀灭率99.999999%以上。6.5.1 灭菌方法与原理1、化学灭菌 2、物理灭菌1、化学灭菌用化学物质杀灭微生物的灭菌操作。化学灭菌剂：氧化剂类等，卤化物类，有机化合物等。细胞死亡。 应用：皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌 区域的台面、地面、墙壁及空间的灭菌。机

11、理：蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，2、物理灭菌各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等 进行灭菌 紫外线等射线：局部空间 干热灭菌：实验室器皿蒸汽灭菌：培养基效果好，操作方便，广泛使用。6.5.2 培养基灭菌1、微生物高温死亡动力学与灭菌的关系 微生物受热死亡过程的一级动力学反应：dX/dt= kdX微生物浓度与灭菌时间成正比，浓度越高，灭菌时间越长。灭菌时间与比死亡速率之间的关系kd与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关 以杀死芽孢的温度和时间为指标。 确保彻底灭菌，实际操作中增加50的保险系数。2、培养基灭菌的操作方式（1）分批灭菌操作，间歇灭菌,实罐灭菌： 配制好培养基输入发酵罐内，

12、直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度。 特点：不需其他的附属设备，操作简便，手动。 缺点：加热和冷却时间较长。营养成分损失较多， 罐利用率低。适合小批量生产规模。分批操作的灭菌过程加热升温： 维持灭菌温度： 1530min，121； 0.090.10 MPa 冷却降温： 每段对灭菌的贡献 于取决时间长短。分批灭菌的操作过程 通入蒸汽：空气管、夹套通入蒸汽。 加热升温：70，取样管、放料管通入蒸汽。 维持保温：120，罐压0.1MPa，排气。调节进汽和排气量，维持30min。 冷却降温：依次关闭排气、进汽阀。罐压低于空 气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却

13、水降温。（2）连续灭菌操作 高温短时灭菌操作，连消： 培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。 加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由 不同的设备执行：加热器，保温设备，冷却器。（2）连续灭菌操作流程图 培养基与高压蒸汽直接混匀，达到灭菌温度 （130140）（2）连续灭菌操作过程 配料：配料罐，配制培养基。 预热罐：定容和预加热。70 90。 加热器：培养基与蒸汽混合， 快速升到130140。 维持罐：维持灭菌时间,5 7分钟。 冷却管：培养基经过冷却水 管冷却。4050。 输入灭菌的发酵罐中。连续灭菌的特点1）高温快速灭菌工艺，营养成分破坏

14、的少；2）热能利用合理，易于自动化控制；3）不适合粘度大或固形物含量高的培养基灭菌；4）增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。 5）对压力要求高，一般为0.45-0.8 MPa。6.5.3 空气除菌操作工艺1、发酵对空气的要求好氧微生物需要氧气供应，通入空气。 连续一定流量的压缩无菌空气。 空气流量：一般0.1-2.0。 压强：0.2-0.4 MPa。空气质量：相对湿度小于70；比培养温度高1030；洁净度100级，或失败率103。2、工业制备大量空气的方法 加热灭菌：利用空气压缩时所产生的热量除菌，无菌化程度不高的发酵过程。 静电除菌：通过高压电流场，带电粒子被吸 附。 介质过滤：捕集

15、粒子及各种微生物。发酵工 业采用。3、空气除菌原理 空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5um。 离心场作用：颗粒及其微生物沉降 直接被截留：颗粒惯性碰撞，相互集聚成大颗粒。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。 静电引力：有一定作用。4、空气过滤介质 膜过滤介质：孔径小于被截留微生物体积硝酸纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜，四氟乙烯、纤维素树脂微孔滤膜。0.1-0.5um 深层过滤介质：空隙大于被截留微生物体积。 纤维状或颗粒状：棉花（50um）、玻璃纤维、活性炭 过滤纸：超细玻璃纤维纸（1-1.5um） 金属烧结管：单根或几十根甚至上百根金属微孔滤管安装在过滤器内。5、空气灭菌工艺过程

16、灭菌方法与原理：化学、物理 培养基灭菌：间歇式，连续操作 空气除菌：过滤除菌工艺（1）与灭菌相关的几个概念有何不同？ （2）比较分析培养基的间歇和连续灭菌工艺的优缺点及操作要点。（3）空气过滤灭菌的工艺过程及其主要关 键点是是什么？6.3 微生物菌种建立6.4 培养基制备 6.5 灭菌工艺6.6 培养技术6.6发酵培养技术 选择合适的培养基；提供适宜的环境条件 微生物发酵工艺过程的三个工段： 种子制备 接种 发酵培养6.6.1 种子制备 种子的制备： 种子的逐级扩大培养过程。 获得一定数量和质量的纯种过程。1孢子制备 种子活化：将保存菌种接种在固体培养基上，在适宜条件下培养，恢复其固有生物特性

17、。 放线菌孢子：采用琼脂斜面培养基。 霉菌孢子：大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等 天然农产品为培养基。 细菌：采用碳源有限而氮源丰富的配方。2生产种子制备 摇瓶种子制备：母瓶、子瓶。 种子罐种子制备：一级、二级、三级种子。 种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数 确定种子级数的因素: 1、菌种生长特性及菌体繁殖速度：生长快，少2、发酵罐的容积：越大，多3、产物的品种及生产规模：越大，多 4、所选用工艺条件：有利于生长的工艺，少种子扩大培养罐发酵类型的定义 一级发酵：将孢子或菌丝接入直接发酵罐 二级发酵：经过一级种子罐，再到发酵罐；谷氨酸生产 三级发酵：二级种子扩大培养，经过二次种子罐， 再接入

18、发酵罐。青霉素 生产 四级发酵：三级种子扩大培养，经过三级种子罐， 再到发酵罐。链霉素生产菌接种方式 单种法：一只种子罐接种一只发酵罐。 双种法：两只种子罐接种一只发酵罐。 倒种法：从发酵罐中取出一定量发酵液，接 种到另一个发酵罐。6.6.2 培养技术1、固体表面培养技术：Solid surface culture 原始，最早采用。 2、液体深层培养：Liquid submerged culture主要的发酵培养技术3、高密度培养 （high cell density culture） 概念：菌体浓度（干重）至少达到50g/L以上 的一种理想培养，发酵工艺目标和方向明确。 优点:缩小发酵体积

19、增加表达量 成本低，生产率高。6.6.3 发酵培养的操作方式1、分批式操作；间歇式操作；不连续操作 2、流加式操作，补料分批式操作 3、半连续式操作，反复分批式或换液培养 4、连续式操作，衡态操作5、灌流式操作，不断灌注新营养，取出条件培养基。1、分批式操作培养液一次性装入发酵罐，一次性接种，经过一段时间培养，一次性卸出全部培养物。 特点：非衡态过程发酵体系的组成（基质、产物及细胞浓度）都随发酵时间而变化。 缺点：开始时基质浓度很高，到中后期，产物浓 度很高，对发酵不利。 辅助时间：清洗罐，装料、灭菌，时间长。2、流加式操作装入大部分培养液，一次性接种，在培养过 程中连续不断补充新培养基，但不

20、取出培养液。 特点： 流加能源和碳源物质及氨水等。 克服了批式的缺点，使生长和生产保持适宜水平。 缺点：整个发酵体积不断增加3、半连续式操作培养液一起装入发酵罐，一次性接种。间 歇取出部分发酵培养物（带放），同时补充同等数 量的新培养基；然后继续培养，直至发酵结束。发酵罐内的培养液总体积保持不变使生长和生产保持适宜水平。丧失部分前体，丧失部分菌体，非生产菌 突变4连续式操作培养液一起装入发酵罐，接种后培养过程中，不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，直至发酵结束。恒定状态的发酵，发酵罐内体积及其物系的 组成将不随时间而变。 培养基连续稳定流加；产物连续稳定收获； 提高菌体密度；自动化。时间长，杂菌污染、突变机会增多。5、灌流（注）式操作培养液一起装入发酵罐，接种后培养过程中，不断补充新培养基，取出部分符合条件培养基，菌体仍然滞留罐内。 （与半连续培养不同处）除去有毒害的代谢物补充营养物质 发酵培养的基本过程 培养技术:概念与特点 操作方式：区别，特点（1）如何种子罐级数确定？ （2）各种操作方式的异同点，如何选择应用？