鼠青光眼模型构建方法研究进展Word格式文档下载.docx

1、传统青光眼的治疗主要通过手术和药物,降低眼压以达到保护视神经的作用,但部分病人眼压正常后视神经的损伤仍然进展7。近年来,青光眼视神经保护的方法8大体可分为: （1）外源性补给神经营养因子:脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophin factor,BDNF）、睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）、胶质源性营养因子（glial cell derived neurotrophic factor,GDNF）等; （2）避免毒性物质损害:抗氧化剂、自由基清除剂和一氧化氮合酶抑制剂等; （3）干扰凋亡途径:抑制凋亡蛋白酶、抑制

2、内核酶和促进bcl-2过度表达等; （4）与受体相互作用:NMDA受体拮抗剂、受体阻滞剂和2-肾上腺素能受体激动剂等; （5）其他:抑制蛋白合成、抑制单胺氧化酶和减少钙内流等。随着对青光眼发病机制和治疗方法探索的进一步深入，如何建立合适而准确的青光眼动物模型成为广大科研工作者亟需解决的首要问题之一。啮齿类动物的眼睛与人眼解剖结构的相似, 如小梁、Schlemm管、睫状体、视网膜血管等9另外，鼠类容易用转基因技术改造和繁殖,花费较少,因此，鼠青光眼模型逐渐得到更多的应用10。本文就鼠青光眼模型的应用的发展和现状作一综述。二、 鼠青光眼模型的分类及其构建方法发展探究鼠青光眼模型主要分为两大类：非高

3、眼压青光眼模型和高眼压青光眼模型，其中前者被用来研究某些特殊类型青光眼，而后者被用来观察与眼压升高相关的病理变化。1非高眼压青光眼鼠模型1.1玻璃体腔内注射兴奋性氨基酸Dreyer EB11等研究发现在玻璃体腔内注射兴奋性氨基酸谷氨酸或N-甲基-D-天冬氨酸 （NMDA）,可以在不影响眼压的情况下引起视网膜细胞的死亡,这种方法被用来制作研究兴奋性氨基酸在青光眼中的作用的动物模型。谷氨酸和NMDA均会引起视网膜神经节细胞（retinal ganglial cel,l RGCs）死亡,大鼠玻璃体腔注射谷氨酸或NMDA 20200 nmol后1 h就会出现细胞固缩12,注射后第6 d可见RGCs死亡

4、13,而小鼠的眼球较小,剂量可减少到210 nmol。相对于单次快速注射,多次低浓度玻璃体腔内注射兴奋性氨基酸也可以产生相似的视网膜损伤。Vorwerk等14的研究证明,每隔5 d注射2.5 nmol的兴奋性氨基酸持续3个月后,随着视网膜的兴奋性氨基酸水平逐渐提高,RGCs逐渐凋亡，细胞数量可减少42%。Siliprandi等15发现NMDA会导致剂量依赖性胆碱乙酰基转移酶的缺乏,说明神经细胞的功能受损。同时观察到Thy-1 mRNA（一种RGCs的特异标志物）在损伤视网膜的表达显著减少16,进一步验证了注射NMDA除可以损伤RGCs外,同时会导致视网膜内核层细胞的凋亡。用玻璃体腔内注射兴奋性

5、氨基酸的方法建立的青光眼模型,建模时间短、可重复性强,其缺点为，模型建立在氨基酸毒性单一机制基础上,而此机制目前国际上尚有争议。1.2 视神经损害雷季良等17在显微镜或解剖镜下通过眶内部眼球后15mm处离断视神经,建立视神经损伤动物模型,这种方法损伤了视神经的所有轴突,从而导致时间依赖性的RGCs死亡,在手术后1周约50%的RGCs死亡,而术后2周所有的RGCs会消失,失去视觉功能。大鼠视神经离断后4个月,视网膜电图（electroretinogram,ERG）完全消失18，19。此法属完全性视神经损伤, 可以模拟青光眼视神经损伤的病理学变化,但不会影响到视网膜动脉和静脉,因此不会影响视网膜的

6、血供。简单易行,容易保证实验动物致伤量的一致性。Yoles等20的研究表明,视神经损伤也可以用外力挤压视神经的方法获得,这种方法可以对视神经产生不同程度的损伤,较视神经离断更加接近青光眼的病程,常被用来研究RGCs的变性病理过程及筛选视神经保护的药物。但目前尚无统一的方法来标准化操作过程,如何提高模型的可重复性有待解决。1.3 内皮素诱导视神经损伤1995年，Sugiyama T21等研究证明,在血压正常的原发性开角型青光眼患者,尤其是进行性视野缺损的患者（什么部位或体液？）内皮素-1的水平明显高于正常同龄人,玻璃体内或视神经周围注射内皮素-1可以导致视网膜局部缺血。家兔和非人灵长类动物眶内注

7、射内皮素-1导致视网膜局部缺血的模型已有报道。2004年，Chauhan等22对模型进行改良并用于大鼠,内皮素-1经由渗透泵注入球后,RGCs会呈时间依赖性凋亡。内皮素-1引起视神经损伤的机制尚未完全阐明。2 高眼压青光眼鼠模型2.1 自发性高眼压DBA/2J和AKXD-28/Ty的纯系小鼠年老时会自发性眼压升高并产生类似于人类青光眼的视网膜疾病，适于进行青光眼机制和干预的研究。DBA/2J小鼠在78个月龄时发生自发性高眼压，表现为虹膜萎缩,色素播散,虹膜前粘连,眼压升高,形成了进行性继发性闭角型青光眼模型,类似于人的色素播散综合征和角膜虹膜内皮综合征23。长期高眼压可引起DBA/2J小鼠RG

8、Cs凋亡,同时伴视盘神经纤维层变薄以及视盘变大。同一小鼠的两只眼以及同龄的不同小鼠的眼压变化并不相同,随着房水生成系统的退化,DBA/2J小鼠的眼压会在其1012个月龄时有所下降。两种纯系小鼠模型的主要不同点在于AKXD-28/Ty小鼠不发生色素播散,只有虹膜基质的萎缩,同时其RGCs和视神经对高眼压更敏感24，25。2.2 光照法一种较温和的引起眼压升高的方法是使动物24 h暴露于光照的环境中,影响了动物的昼夜节律从而刺激房水分泌26。这种低的光照强度并不会引起视网膜光毒性,并且缓慢升高的眼压更接近青光眼患者的眼压变化。与临床上青光眼患者类似,但需要相当长的造模时间才能引起视网膜的变化27因

9、此,这种模型对于青光眼视网膜病变的研究具有很大的局限性。多用来研究疾病相关因子,结合其他引起眼压升高的方法研究眼压升高与视网膜病变的关系。1994年，Mermoud等28在48只大鼠的前房内注射S2抗原,用Tono2Pen22眼压计测量眼压。平均眼压:注射前为（2015514）mmHg,注射后25天下降到（1615413）mmHg,在620天上升到（3518911）mmHg。注射后921天,组织病理学检查发现:眼前节和后节都有炎症反应。用FITC2白蛋白稀释技术测量房水生成和用前房压力灌注法测量房水流畅系数。注射S2抗原后3天房水生成下降,而房水流畅系数增加,7和14天房水生成增加,而房水流畅

10、系数正常或下降。该模型有三个特点:（1）眼压升高;（2）高眼压合并有临床和组织学上的炎症反应;（3）有色素膜炎后遗症,眼压不稳定。该研究作者认为:这种模型可用于研究合并有色素膜炎的眼压变化机制。翌年,Mermoud等29为了研究注射S2抗原后2和6天眼压下降的原因,测量房水中前列腺素E2和F2的水平。发现早期眼压下降的原因是房水中前列腺素F2增加的结果。2.3 巩膜上静脉注射高渗生理盐水1997年，Morrison等30在大鼠的上巩膜静脉内注射高渗盐水,使房水排出道产生瘢痕,诱发高眼压。他们用一特制的C型塑料环暴露大鼠1条巩膜上静脉,同时压迫大多数巩膜上静脉,将50L高渗盐水注入暴露静脉,由于

11、大多数巩膜上静脉被压迫,注入的高渗盐水多流入巩膜静脉窦以及前房,炎症以及瘢痕的形成使这些组织硬化,该实验中9只眼注射1次后眼压升高,7只眼多次注射后眼压升高,1只眼注射后形成低眼压，眼压平均升高728mmHg，程度与大鼠个体对于高渗盐水反应的差异有关,对于部分大鼠二次注射是必需的。这种方法引起的高眼压是可以保持的,有报道可以延长至200 d。组织学检查发现:在高眼压影响下,视神经轴突受损,涉及横断面神经区的100%。眼压不太高或持续时间较短,神经区的受损范围为0.5%10.4%。受损神经70%,集中在颞上侧。1998年，Morrison等31在16只成年大鼠的一只眼的上巩膜静脉内注射高渗盐水。

12、然后双眼每日点下列药物2次:人工泪液（n=6）;015%倍他洛尔（betaxolol）（n=5）;0.5%氨可乐定（apraclonidine）（n=5）。在动物清醒情况下,持续测量眼压17日,然后取材观察。人工泪液治疗组,试验眼为（392）mmHg,对照眼为（291）mmHg,两者差别明显;倍他洛尔和氨可乐定治疗组,试验眼的眼压分别为（297）mmHg和（294）mmHg,对照眼均为（281）mmHg,两者无明显区别。就所有试验眼来说,倍他洛尔和氨可乐定治疗眼的平均眼压明显低于人工泪液治疗眼。对试验眼视神经的定量组织学检查发现:在人工泪液治疗的6只眼中有4只眼视神经受损达100%;而在两种抗

13、青光眼药物治疗的10只眼中只有3只眼的视神经受损。结论:对于鼠青光眼鼠模型,抗青光眼药物降低眼压有助于防止视神经受损。2000年，Jia等32在17只大鼠的一条上巩膜静脉内注入高渗盐水,使眼压升高。然后分别在白昼和夜间测量眼压,持续34天。发现夜间眼压升高比白昼明显, 推测和房水生成的生理周期有关。2002年，Chauhan等33把高渗盐水注射到49只大鼠一只眼的一根上巩膜静脉内。然后在动物清醒情况下用手持眼压计每日测量眼压2次,持续13个月。同时用扫描激光断层摄影（scanning laser tomograhp hy）和ERG检查视乳头地形图和视网膜功能。峰值眼压:在试验眼比对照眼高15m

14、mHg（A组）的16只眼中有9只眼（5613%）发生进行性视乳头凹陷;而在试验眼比对照眼眼压高不足15mmHg（B组）的21只眼中都没有出现视乳头凹陷。ERG异常（限于b波）在A组中为64.17%,而在B组中仅为81.7%。当轴突丧失55%以上时进行性视乳头凹陷才明显出现。轻度和中度轴突丧失的眼,ERG在正常范围,轴突丧失超过70%,ERG方出现明显异常。在这种青光眼模型中,视神经构造和功能的变化和峰值眼压有高度相关性。2.4 激光光凝房水流出通道1998年,Ueda等34报告一种诱发大鼠青光眼模型的新方法：先在大鼠前房内注入印度墨水,一周后碳粒沉积在前房角,沿角膜缘形成一条黑带。然后用激光直

15、接（不用前房角镜）照射小梁。重复照射到眼压升高到25mmHg为止。4周内所有大鼠眼压升高。注射墨水后12周取材,对眼进行组织学检查,发现前房角有激光引起的前粘连、碳粒被睫状体内巨噬细胞吞噬、视乳头出现凹陷,说明产生了青光眼性视神经损害。2002年，Levkovitch-Verbin等35不在前房内注射墨水,直接通过角膜缘用二极管激光（波长532nm,能量014W,时间017秒）照射小梁,有些眼同时照射上巩膜静脉。激光照射后,所有大鼠眼的眼压都高于对照眼的（1914211）mmHg。同时照射小梁和上巩膜静脉组（联合组）为（4910611）mmHg;单独照射小梁组（小梁组）为（3410517）mm

16、Hg。6周后的平均眼压:联合组为（2515219）mmHg;小梁组为（2210118）mmHg。激光照射眼的眼压持续3周高于对照眼。联合组的视网膜神经节细胞在第1周丧失（16111414）%,第6周丧失（59172517）%,第9周丧失（70192316）%。研究证明激光照射小梁网或巩膜上静脉均可引起大鼠眼压升高、RGCs死亡以及视神经病变,且这种损伤并不局限在RGCs层,视网膜的各层厚度均减少。同年，Martin等36用这种青光眼大鼠模型进行了视网膜谷氨酸传送变化的免疫组织化学的研究。2003年Lam等37发展了这种诱发青光眼大鼠模型的方法。他们用30号注射针头插入前房,先抽出10微升房水,

17、然后注入等量印度墨水。针头保持在原位30秒,以减少墨水的漏出。7天后,用氩激光系统（波长620647nm,光斑200m,能量200mW,时间0.2秒）向小梁中碳粒沉积的黑带在360范围照射200个点。激光照射后1、5、7天,眼压均升高。照射后第3天的眼压:治疗眼为（131373134）mmHg;对照眼为（81551131）mmHg。激光照射后14天眼压恢复正常。在激光照射后1、3、5、7、14天,用抑制神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白、S2100,EDI、OX42等抗体进行免疫组织学检查,以评价视网膜神经节细胞在高眼压下丧失的程度。激光光凝法产生的眼部损伤与临床患者相似,但由于鼠眼

18、体积较小,对操作者技术要求高,需要专门的激光设备,不适合普遍推广。2.5 视网膜缺血及再灌注模型1991年，Bfichi等38在大鼠前房内注入生理盐水,眼压升高至110mmHg（1mmHg=0.133 kPa）,当眼压超过血管收缩压,眼内血液流动就会停止。这种方法可引起视网膜局部或全部缺血,从而导致RGCs死亡,同时伴有视网膜神经纤维层变薄,严重程度与缺血的时间相关,当血液重新灌注后,损伤并没有终止,并持续加重。1996年，AdachiM39等采用同样的方法复制青光眼鼠模型，并证明缺血会引起视神经的损伤,可见线粒体的破裂、轴突的退化、髓鞘的坏死等。ERG的a波和b波振幅明显下降。2003年，G

19、rozdanic S等用计算机化的瞳孔测量法对该法处理鼠模型进行评估,缺血眼的瞳孔光反射幅度增加、潜伏期延长,而反射的最大速率下降40证明视网膜和视神经的功能损伤。此模型的缺点在于不能区分是高眼压还是视网膜缺血导致RGCs的死亡。2.6 烧灼眼外静脉模型近年来，多项研究表明，烧灼2条或更多的眼外静脉会引起眼压升高,眼压升高的程度与烧灼静脉的数量有关。1995年，Shareef等41烧灼大鼠3条巩膜上静脉,增加了小梁网后的阻力而达到升高眼压的目的。1999年，Neufeld等42用氯胺酮（80mg/kg）和甲苯噻嗪（12mg/kg）的混合制剂给重约250克的16只大鼠进行全麻,然后切开结膜,用小

20、肌肉钩在眼球赤道部钩起上巩膜静脉,再用眼科烧灼器对静脉进行烧灼,使之闭塞。每只鼠的一只眼闭塞3根上巩膜静脉。用气压眼压计测量眼压。烧灼后6个月内,治疗眼的眼压约为18mmHg,对照眼约为1115mmHg。作者用这种青光眼模型研究NOS22（氧化氮合酶）的抑制剂氨基胍（aminoguanidine）对高眼压下视网膜神经节细胞进行性丧失的影响。眼底检查发现:正常眼和用氨基胍（口服）治疗的青光眼没有出现视乳头凹陷,而没有治疗的青光眼出现了视乳头凹陷。眼压升高6个月后,组织学显示:高眼压下视网膜神经节细胞丧失的程度,未用氨基胍治疗的眼为（35.95.7）%;而用氨基胍治疗的眼仅为（9.63.5）%。氨

21、基胍对眼压没有影响,但对视神经有保护作用。该研究证明,用青光眼鼠模型研究治疗青光眼的神经保护药物是可行的。2000年，Ko等43研究证明这种方法引起的视网膜损伤不仅引起RGCs的死亡,还会使神经纤维层变薄以及视神经退行性变,具体表现为ERG的a波和b波时间依赖性下降以及瞳孔光反射的减弱,但这种方法引起的眼压升高程度没有光凝法明显。烧灼眼外静脉法和其他方法比较起来操作简单,缺点是影响了眼部血供,可能会引起眼内局部缺血。同年，Mittag等44的研究证明,该方法所引起的高眼压是暂时的,会在23个月后恢复到正常水平,可能与新生血管的产生有关,为了减少新生血管的产生,反复结膜下注射5-氟尿嘧啶是必需的

22、。2002年，Naskar等45用烧灼2根上巩膜静脉的方法诱发青光眼大鼠模型。用Tono2Pen眼压计测量眼压。眼压在烧灼后立即升高。烧灼眼为（35.132.11）mmHg;对照眼为（15.141.14）mmHg。作者用该青光眼模型研究视网膜神经节细胞（RGCs）在高眼压下早期变化的特点。RGCs的丧失可以发生在眼压升高后20小时左右。他们对20只鼠进行RGCs的定量研究,大鼠眼压升高后3、5、10周取材,将定量RGCs计数和对照眼的视网膜进行比较。眼压升高后3周为（16.577.8）RGCs/mm2,占对照眼（19.273.1）R GCs/mm2的86%;眼压升高后5周为（140090）RG

23、Cs/mm2,占对照眼的73%。眼压升高215个月后为（1141130）R GCs/mm2,占对照眼的59%。2.7 眼外静脉结扎2006年，Yu S等研究证明持续结扎大鼠巩膜上静脉会引起轻度的眼压升高,晚期可产生RGCs选择性死亡以及视神经乳头凹陷,实用性尚需进一步评估46。2.8 前房注射透明质酸钠2002年，Benozzi等47显微镜下,将透明质酸（10mg/ml,在盐水中）25微升注入到全麻的大鼠前房内,对侧眼注入等量的生理盐水作为对照。几乎所有动物在注射后24小时之内角膜缘注射点周围都有局部角膜水肿。这些并发症在透明质酸注射眼和对照眼之间并无区别。用Tono2Pen XL眼压计测量眼

24、压,12只大鼠在一次注射后24小时眼压开始升高,持续至少5天。第5天的眼压:治疗眼为（1515110）mmHg;对照眼为（1119017）mmHg。为了研究多次注射对眼压的影响,在20只大鼠的一只眼的前房内每周注射透明质酸1次,持续9周。每周在注射前测量眼压1次。治疗眼在研究的10周时间里,眼压稳定在升高的水平。第4周的平均眼压:治疗眼为（2611对照眼为（1117016）mmHg。为了研究降眼压药物对这种青光眼大鼠模型的影响,作者把几种抗青光眼药物（1滴）分别点入10只透明质酸诱导的高眼压的鼠眼内。人工泪液不影响眼压,01005%适利达（latanoprost）、012%布林唑胺（brimo

25、nidine）、015%噻吗心安均使眼压明显下降。作者认为,在前房内注射透明质酸,可能是一种诱发青光眼大鼠模型的方法。2005年，Moreno等 48同样采用前房注射透明质酸钠复制鼠青光眼模型，并证明长期的高眼压可引起RGCs死亡以及视神经萎缩,并可引起暗视野ERG a波和b波以及振荡电位的下降。2.9 前房注射其他物质最近Urcola等49研究证明前房重复注射乳汁微粒可导致大鼠眼压缓慢升高,并可持续较长时间,RGCs数量水平减少与眼压升高呈正相关。罗学港等50用生理盐水加压灌注大鼠前房,使眼压升高到70mmHg,并在二道生理记录仪监测下维持3 h,造成高眼压模型。缺点和上述的透明质酸酶前房注

26、射相似。三、 青光眼鼠模型眼压测量方法及眼压计发展史多年来,青光眼的基本诊断指标仍然是眼压、眼底、视野及前房角4项。在我们使用青光眼鼠模型进行试验研究时,眼压是一项重要的监测指标，如何简单而准确测量眼压成为我们关注的问题之一。为了准确测量鼠的眼压,人们设计了不同的眼压计。3.1眼压计发展史1863年第一台眼压计问世,即为Donder设计出在巩膜上测量眼压的压陷眼压计,虽因该仪器的阻力太大,不适用于临床,但是它的出现标志着仪器发展过程中的重大突破,为以后眼压计的研制起了开创作用。1885年,Maklakoff抛弃了在巩膜上测量的方法,首创压平眼压计。他用重10 g的锤柱施于角膜,以其压平角膜面积

27、之大小而测知眼压。以后Filator（1913）及Kalfa（19281936）对Maklakoff眼压计进行改进,并用改进后的眼压计进一步详细研究眼球弹性,遂成为现在的费-卡氏弹性眼压计。1905年,Schiotz发明了比较实用的压陷眼压计,并不断改进,因该仪器简便价廉,易于操作,至今仍为世界各国所通用。在Schiotz眼压计的基础上进行改良的形式很多,在此不一一赘述。但值得提出的是,到了1948年及1952年,Friedenwald及Moens先后发明了电眼压计,这就为Schitz眼压计增添了新的活力。电眼压计测量眼压更为精确可靠,且阻力小,比较灵敏,其刻度表放大倍数大,连接记录部分可以做眼压描记,为青光眼研究提供了更有利的条件。1954年,Goldmann报道的新设计的压平眼压计系测量角膜达到一定大小扁平面（直径3.06 mm）所需要的压力,避免了Schitz眼压计和弹性眼压计受眼球壁硬度影响的缺点,其所测知的眼压值比较可靠。以后又相继面世了Perkins手持式压平眼压计、Draeger手持式压平眼压计以及气动压平眼压计（pneumatic applanation tonometer）。1971年,Grollman设计出非接触性眼压计,1974年Forbes等首次报道其临