柱色谱注意的事项文档格式.docx

1、 关于无水无氧柱适用于对氧，水敏感，易分解的产品，可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收

2、集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。四：关于湿法、干法上样湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的

3、吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶，那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。溶剂的选择当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有

4、时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时

5、就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。 另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。六：关于操作问题1、 装柱 柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把

6、柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！2、 加样 用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（24cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）

7、夹带样品快速下行。3、 淋洗剂的选择 感觉上要使所需点在rf0.20.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。4、 样品的收集 用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品。如

8、果都用小试管那工作量又太大。5、最后的处理 柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚（6090）.硅胶的预处理我们以浓盐酸浸泡硅胶14小时，然后用蒸馏水洗涤硅胶4次后，将起进行减压抽滤，后不断加

9、蒸馏水冲洗。在1小时之后，抽滤的水呈中性，但仍然含有氯离子。经过4小时不断的冲洗才使得抽滤液中基本不含氯离子。晾干一周后，在110烘箱中活化2小时。活化后的硅胶加石油醚浸泡并搅拌均匀。在装柱时，宜使用口径较大的玻璃漏斗置于 层析柱上部，注入1/2高的石油醚，打开下部活塞，然后尽量均匀地将硅胶倾入漏斗，这样可以防止层析柱中形成断层（这一步是实验的关键步骤）。装柱装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装

10、柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂走柱子，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易

11、察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂

12、，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。干法装柱就是不加溶剂直接将硅胶加入柱内，将拌样的硅胶洒于其上，然后在上面加一层保护硅胶和棉花，之后，将洗脱液倒入其内。湿法装柱装的柱子匀称，切不至于使样品在硅胶与溶剂发生防热的时候而变化，样品性质稳定适用。硅胶层析硅胶柱层析技术 硅胶柱层析原理 硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、

13、再解吸过程。硅胶柱层析流动相极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸硅胶柱层析惯用方法 1.称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸

14、钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱

15、剂，而不会冲坏硅胶表面。6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。注意事项 1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化 2.将柱子必

16、须装平整、均匀 3.考虑有限柱填料的吸附量 4.可考虑用剃度法分开并洗脱 柱层析分离的实验方法和技巧 1B= vr_Gq 用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。3 淋洗剂的选择。感觉上要使所需点在rf0.20.3左右的比较好。4 样品的收集。用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，wuwu。5 最后的处理。柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送

17、分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。植化经验谈之二：湿法上硅胶柱的注意事项从事天然产物的人员，装柱是基本功，最常用的就是硅胶柱，又分干法上柱和湿法上柱，今天谈谈湿法上柱的个人经验。1. 湿法上柱时，先要匀浆，把硅胶倒入溶剂中，并充分搅匀（排除硅胶中的气体，同时也使得硅胶在溶剂中充分膨胀），这个大家都会2. 将硅胶倒入玻璃柱后，为了填充得结实（尽可能多装些填料），有些人喜欢用手或其他较软的工具敲打玻璃柱。 这种做法反而会带来害处，因为不均匀敲打会使填料在柱内不均匀，影响分离效果。最佳的做法是采用加压的办法（建议购一个3W左右的充氧泵）

18、，让其均匀地自然下沉，同时放置一段时间效果会较好.老板先说她们初步粗分打段时就不对，不能分得太细打三、四段就可以了，一开始时不要追求分到纯的化合物，因为那是不可能的。 中间我们讨论了用硅胶柱层析分离提纯化合物的细节问题，从装柱，上样，到收集处理，讨论很激烈。她们有两个都是用干法装柱，干法上样，老板说怎么能干法装柱呢？分离效果肯定不如湿法。理论上是湿法装柱好，但她们也是经验总结出来的结论，干法确实好。我保持中立，我认为是习惯问题。可心里很想让老板找个时间用实验验证到底谁说得对。我们过柱子的方法可能都不对，因为我们学习的就不对，或者就没真正学过。 另外还说到了一个我认为很值得讨论的问题，就是氯仿甲

19、醇体系作展开剂在薄层板上效果非常好为什么一上柱子就不行了呢？我在实验过程中还发现了一个奇怪的问题。比如一组样品a和 b，在氯仿乙酸乙酯体系中展开a的Rf比b小，而如果用氯仿甲醇就会是相反的现象，很多次都是这样。不知大家是不是有过同样的经历呢？很想和大家讨论一下，希望大家能畅所欲言，提出自己的宝贵见解，和大家分享自己的经验，让大家踏着你正确的脚印少走弯路。不知是否有人已经拥有，我简单描述一下：是一个国外的老师讲的柱层析方法。讲了从寻找展开剂、装柱子的方法、柱高度的选择、上样到收集处理过程中的很多注意事项。装柱:大多采用湿法装柱,干法装柱会很容易产生气泡,影响分离效果,尤其多余小柱子,气泡影响更大

20、.但我也见过用干法效果更好的.有人在选择装柱方法前用滴管模拟柱子进行比较.粗分的目的就是分段,粗分选择的柱子很难分到纯的化合物,只有化合物含量足够大时才能析出,但一般的粗分过程中一两个含量高的物质析出.我遇到过洗脱系统不一样,Rf就不一样的状况,这是可能的.分类 按两相状态气相色谱法 气固色谱法气液色谱法 液相色谱法液固色谱法液液色谱法 按固定相的几何形式柱色谱法（column chromatography） 柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。纸色谱法（paper chromatography） 纸

21、色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。薄层色谱法（thin-layer chromatography, TLC） 薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：吸附色谱法（ adsorption chromatography ） 利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。分配色谱法（ partition chromato

22、graphy ） 利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。离子交换色谱法尺寸排阻色谱法亲和色谱法原理 色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。 吸附色谱 吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程 吸附色谱的分配系数表达式如下： K_a =f

23、racX_aX_m 其中Xa表示被吸附于固定相活性中心的组分分子含量，Xm表示游离于流动相中的组分分子含量。分配系数对于计算待分离物质组分的保留时间有很重要的意义。分配色谱分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定想和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。 分配色谱的狭义分配系数表达式如下： K=frac=fracX_s/V_sX_m/V_m 式中Cs代表组分分子在固定相液体中的溶解度，Cm代表组分分子在流动相中的溶解度。离子交换色谱离子色谱分析法出现在2

24、0世纪70年代，80年代迅速发展起来，以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象。 离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。 离子交换色谱的分配系数又叫做选择系数，其表达式为： K_s=fracRX+X+ 其中RX + 表示与离子交换树脂活性中心结合的离子浓度，X + 表

25、示游离于流动相中的离子浓度。凝胶色谱凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小；改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。如反应对水没有要求，可以用92的NaCN，含一定的水，呈湿粉状后处理还是次氯酸钠好用一些解毒剂：亚硝酸异戊酯，口服或注射装柱时最好一次性将所需硅胶装入柱子，然后

26、反复地笃实并用真空泵抽走硅胶中的空气，两者最好交替进行多次，直至柱顶硅胶平滑而略凸，整个柱子硅胶颗粒均匀，常压柱注意不得让洗脱液流干，加压柱加压前第一次加的洗脱液量一定要充足，以能将柱子中的空气赶完，不然柱子在添加洗脱液是柱子就容易分层。个人经验是 用来搅拌硅胶的二氯甲烷的量适当的多些（稀些） 搅匀后不要急于倒进柱子 让二氯甲烷浸泡一会硅胶 倒入时要快 到完后可以用洗耳球适当对称的敲击几下便可 还可以考虑硅胶倒入后加压快速把硅胶压平二氯甲烷沸点太低，夏天用不太好使，湿法装柱很容易出现断裂，最好干法装柱。干法颠实后加入样品，在加一层空白硅胶，即可冲柱反相硅胶柱是怎么装柱？是用什么溶剂装的？有什么

27、注意事项吗？通常是用甲醇装柱，沉降好后用起步溶剂（一定比例的甲醇水）置换一下即可注意一定不要超声，这样会破坏ODS由于其颗粒细，流速会慢一些，通常可用中压柱加快流速反相柱湿法上样的时候 ，样品是用起始洗脱剂溶解好，还是用纯甲醇或水溶解好？能溶最好是用起始洗脱剂溶解，不行的话尽量用接近起始洗脱剂比例的系统溶解，此外还可以试试超声溶解，上样前记得过滤一下。超声是欠考虑的 起始洗脱剂就OK谈薄层色谱展开剂选择 根据本人的几年薄层层析经验，参考药典等国家药品标准和有关文献，将 2000版药典一部里部分有代表性的对照品的薄层层实例按展开剂极性排序，并对其规律做一些分析。以下的分析和介绍是总体描述性的，目的是快速、简便地选择展开剂。如果想了解展开剂选择的各种理论，请参考其他专著。选择展开剂，要依据溶剂极性和他们的混溶性，溶剂对被分析物的溶解性，以及被分析物的结构。这里只讨论药典里通常使用的以硅胶为固定相主体的正相薄层，也不考虑板的活性。 列出溶剂极性参数表，方便以下比较展开剂。环已烷 :-0.2、石油醚（类，3060）、石油醚（类，6090）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:1