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1、1） 色氨酸（简写Trp）用电子天平准确称取0.05105色氨酸50mL烧杯中，加入20mL二次蒸馏水，将烧杯放在超声波清洗器中震荡溶解，溶解完全后，将溶液转移至50mL容量瓶中用二次蒸馏水定容、摇匀，作为母液A1，并置于冰箱冷藏。用1mL吸量管从A1中移取1.0mL溶液于10mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容、摇匀，作为标准液A2，并置于冰箱冷藏。用1mL吸量管从A2中移取1.0mL溶液于50mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容、摇匀，作为标准液A3，并置于冰箱冷藏。用1mL吸量管从A3中移取1.0mL溶液于10mL容量瓶中，用pH=7.2的缓冲液定容、摇匀，作为待测溶液。 2） 酪氨酸（简写Tyr）

2、用电子天平准确称取0.0452g酪氨酸于250mL烧杯中，加入100mL二次蒸馏水，将烧杯放在超声波清洗器中震荡溶解，溶解完全后，将溶液转移至250mL容量瓶中用二次蒸馏水定容、摇匀，作为母液B1，并置于冰箱冷藏。用1mL吸量管从B1中移取1. 0mL溶液于100mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容、摇匀，作为标准液B2，并置于冰箱冷藏。用1mL吸量管从B2中移取1.0mL溶液于10mL容量瓶中，用pH=7.2的缓冲液定容、摇匀，作为待测溶液。3） 苯丙氨酸（简写Phe）用电子天平准确称取0.0434g苯丙氨酸于50mL烧杯中，加入20mL二次蒸馏水，将烧杯放在超声波清洗器中震荡溶解，溶解完全后，将

3、溶液转移至50mL容量瓶中用二次蒸馏水定容、摇匀，作为母液C1，并置于冰箱冷藏。用1mL吸量管从C1中移取1. 0mL溶液于50mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容、摇匀，作为标准液C2，并置于冰箱冷藏。从C2中移取1.00mL溶液于10mL容量瓶中，用pH=7.2的缓冲液定容、摇匀，作为待测溶液。同时用10mL移液管移取10mL pH=7.2的缓冲液至10mL容量瓶中，作为空白样。实验结果1、 缓冲溶液最佳pH的选择 实验用苯丙氨酸作为实验分析物质，是由于同浓度的三种氨基酸溶液中，苯丙氨酸的荧光强度最弱。实验所测pH值不同的7组数据，在整理分析数据发现，pH=6.0,6.8两组数据的结果比较反常，

4、舍去，选择后5组数据进行分析比较，扣除空白后得Fr-pH关系图（图1），由图可见，缓冲溶液的最佳pH=7.2。图1 缓冲溶液最佳pH的选取2、 三种氨基酸的荧光光谱的测定1）色氨酸图2.1 色氨酸的荧光光谱1 色氨酸的激发荧光光谱 2 色氨酸的发射荧光光谱1 空白样的激发荧光光谱 2 空白样的发射荧光光谱2）酪氨酸图2.2 酪氨酸的荧光光谱1酪氨酸的激发荧光光谱 2 酪氨酸的发射荧光光谱3）苯丙氨酸图2.3 苯丙氨酸的荧光光谱1 苯丙氨酸的激发荧光光谱 2 苯丙氨酸的发射荧光光谱4）三种氨基酸扣除空白后的相对荧光光谱图2.4 三种氨基酸扣除空白后的相对荧光光谱1 色氨酸的相对激发光谱 1 色氨

5、酸的相对发射光谱2 酪氨酸的相对激发光谱 2 酪氨酸的相对发射光谱3 苯丙氨酸的相对激发光谱 3 苯丙氨酸的相对发射光谱3、 三种氨基酸及空白样的同步荧光光谱1） 色氨酸对色氨酸进行同步荧光扫描，m的取值范围是230-320nm，每隔5nm测量一次。得以下荧光光谱：图3.1.1 色氨酸的同步荧光光谱（m=230-270nm） 图3.1.2 色氨酸的同步荧光光谱（m=275-320nm） 对酪氨酸进行同步荧光扫描，m的取值范围是230-310nm，每隔5nm测量一次。图3.2.1 酪氨酸的同步荧光光谱（m=230-270nm） 图3.2.2 酪氨酸的同步荧光光谱（m=275-310nm）对苯丙氨

6、酸进行同步荧光扫描，m的取值范围是230-310nm，每隔5nm测量一次。图3.3.1 苯丙氨酸的同步荧光光谱（m=230-270nm） 图3.3.2 苯丙氨酸的同步荧光光谱（m=275-310nm）4）空白样根据对色氨酸进行同步荧光扫描，m的取值范围是230-320nm，每隔5nm测量一次。图3.4.1 空白样的同步荧光光谱（m=230-270nm） 图3.4.2 空白样的同步荧光光谱（m=275-310nm）4、 三种氨基酸的同步荧光光谱的一阶导数处理1）实验分析初步判断，色氨酸的最佳同步波长差=55nm。=55nm时，对三种氨基酸扣除空白后进行同步一阶处理得以下结果：s图4.1.1 三种

7、氨基酸扣除空白后的同步导数光谱图（=55nm，左） （=60nm，右）1 色氨酸 2 酪氨酸 3苯丙氨酸（下同）图4.1.2 三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱（=50nm）2）通过对实验数据的整理，分析判断，酪氨酸的最佳同步波长差=75nm。=75nm时，对三种氨基酸扣除空白后进行同步一阶处理得以下结果：图4.2.1 三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱（=85nm,左） （=80nm，右） 图4.2.2 三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱（=90nm，左） （=75nm，右）图4.2.3 三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱（=70nm，左） （=65nm，右）3）实验分析初步判断，苯丙氨酸的

8、最佳同步波长差=15nm。=15nm时，对三种氨基酸扣除空白后进行同步一阶处理得以下结果：图4.3.1 三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱（=25nm，左） （=15nm，右）图4.3.2 三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱（=20nm）5、 最佳同步波长差的选择由4中三种氨基酸扣除空白后的同步导数光谱比较可得三种氨基酸的最佳同步波长差 分别为：色氨酸：55nm；酪氨酸：75nm；苯丙氨酸：15nm。图5 三种氨基酸扣除空白后的同步荧光光谱1 色氨酸（=55nm） 2 酪氨酸（=75nm） 3 苯丙氨酸（=15nm）6、酪氨酸对色氨酸的干扰实验 由5所得，色氨酸的最佳同步波长差=55nm。=5

9、5nm时，从图4.1.1可以看出，此时酪氨酸对色氨酸的荧光强度的测量有一定的影响，因而，对色氨酸进行酪氨酸的干扰实验色氨酸（810-7mol/L）、色氨酸（810-7mol/L）-酪氨酸（110-6mol/L）混合溶液、空白缓冲溶液（pH =7.2）进行同步荧光光扫描，色氨酸以及混合溶液扣除空白后，进行同步一阶处理得以下结果：图6 色氨酸和氨基酸混合溶液扣除空白后的同步导数光谱1 色氨酸 2 色氨酸-酪氨酸混合溶液7、三种氨基酸的线性范围1） 色氨酸（Trp）=55nm 取从大到小浓度范围（510-6mol/L110-8mol/L）的色氨酸溶液共11组，进行同步荧光扫描，并进行扣除空白后的微分

10、处理，取=291nm处的数据整合分析发现，第10、11组数据，即浓度为110-8mol/L和2.510-8mol/L两组数据与整体数据不成线性关系，故舍去。将其他前九组数据进行线性拟合，得以下Ir-c的线性关系图（图1.1）。由图可见：线性斜率B=-1.6986，相关系数R=-0.99987，R2=0.99974缓冲体系pH=7.2图7.1.1 =291nm时的色氨酸的浓度与扣除空白后同步荧光强度导数关系图2）酪氨酸的线性拟合酪氨酸（Tyr）=75nm 取从大到小浓度值的色氨酸溶液共11组，进行同步荧光扫描，并进行扣除空白后的微分处理，取=291nm处的数据整合分析发现，第10、11组数据，即

11、浓度为410-8mol/L和8R2=0.99924图1.1 =231nm时的酪氨酸的浓度与同步荧光强度导数关系图8、检测线1） =55nm时，对空白样进行15次重复扫描，将15组数据进行同步微分处理后，取=291nm处的数据进行标准偏差计算，得到标准偏差=0.7909，=0.7取利用检测限的计算公式进行计算得，检测限为-0.8242010-8mol/L，取8.210-9mol/L.2） 酪氨酸的检测线=75nm时，对空白样进行15次重复扫描，将15组数据进行同步微分处理后，去=231nm处的数据进行标准偏差计算，得到标准偏差=0.7取利用检测限的计算公式进行计算得，检测限为1.810-8mol

12、/L.9、精密度1） 色氨酸：510-7mol/L，=55nm时，对色氨酸溶液进行15次重复扫描，将15组数据进行同步微分处理后，去=291nm处的数据进行标准偏差和导数平均值的计算，得到精密度S，即标准偏差S=4.81631，取S=4.0，导数平均值为-84.24，则相对标准偏差=4.0/84.24=4.75%。2）酪氨酸：10-7mol/L，=75nm时，对酪氨酸溶液进行15次重复扫描，将15组数据进行同步微分处理后，去=231nm处的数据进行标准偏差和导数平均值的计算，得到精密度S，即标准偏差S=2.0，导数平均值为-41.24，则相对标准偏差=2.0/41.24=4.85%。4、回收率1）由色氨酸的线性拟合实验数据整理可得，线性关系最佳的色氨酸浓度为2.510-7mol/L，分别配制浓度为C1=2.510-7mol/L，C2=3.7510-7mol/L三种色氨酸溶液和空白缓冲溶液（pH=7.2），在=55nm，即m=275nm条件下进行同步荧光扫描，并进行同步微分处理后，对=291nm处的Ir，通过线性关系公式进行计算得：X1=2.7665910-7mol/L，X2=4.0794210-7mol/L ，