昆虫抗冻蛋白的分离纯化及特性分析Word格式.docx

1、依据来源的不同，可将抗冻蛋白分为鱼类抗冻蛋白、昆虫抗冻蛋白、植物抗冻蛋白和微生物抗冻蛋白四大类。鱼类抗冻蛋白又分为6大类：抗冻糖蛋白（antifreeze glycoprotein，AFGP），I型抗冻蛋白（AFPI、AFP、AFP、AFP）和高活性抗冻蛋白Hyperactive AFP。植物抗冻蛋白研究较深入的主要为胡萝卜（Daucuscarota）抗冻蛋白（DcAFP）和黑麦草（Loliumperenne）抗冻蛋白（LpAFP）。对微生物抗冻蛋白的研究则还处于起步阶段。Gfimstone等人首先证明黄粉甲Tenebrio molar幼虫能够产生抗冻蛋白，随后，科学家们在分属于9目、20科的

2、50多种昆虫体内发现了抗冻蛋白的存在。目前研究比较透彻的昆虫抗冻蛋白主要包括黄粉虫AFP（TmAFP）、云杉卷夜蛾Choristoneura f umiferana AFP（CfAFP）和赤翅甲Dendroides canadensis AFP（DAFP）。根据其特性的不同，抗冻蛋白又有多种命名，如冰结构蛋白（ice structuring proteins，ISP）、抗冻蛋白（AFP）及热滞蛋白（thermal hysteresis proteins，THP）。抗冻蛋白的主要特征是产生热滞效应和重结晶抑制效应。耐寒生物（freezeavoidance）如大多数昆虫和鱼类抗冻蛋白主要通过热滞效

3、应来保护机体免受冻害，抗冻蛋白降低溶液冰点的作用效果不受分子数量的影响，只受蛋白质性质的影响，即非依数性地降低溶液的冰点，同时不影响融点，从而产生冰点和融点的差值，这个值即为热滞值，它的高低可以用来衡量抗冻蛋白抗冻活性的强弱。而对于可以忍受胞间结冰的耐冻生物（freezetolerance）如大多数越冬的植物和少数昆虫的抗冻蛋白则主要通过重结晶抑制效应来降低生物有机体因体内结冰引起的伤害。抗冻蛋白除了可以特异的、不可逆的与冰晶结合，抑制冰晶生长，同时改变冰晶形态，还可以降低过冷点，抑制成冰核蛋白的作用和降低玻璃化与去玻璃化损伤，以及通过与细胞膜的脂双层结构的结合，提高细胞膜的相变温度改变酰基链

4、的分子包装，减少细胞膜的渗透性，阻止离子渗漏，提高生物有机体的耐寒性。AFP的这些性质可被应用于改良动植物品种和低温保存等，有着广阔的应用前景。本文将对昆虫抗冻蛋白的分离纯化及其特性作一综述。1昆虫抗冻蛋白的分离纯化 1.1昆虫抗冻蛋白分离纯化常用技术 抗冻蛋白多是从经过低温驯化或越冬的昆虫成虫或幼虫体内提取和纯化的。目前，已分别从黄粉虫、赤翅甲、云杉卷叶蛾、松皮天牛Rhagium inquisitor、日本松针瘿蚊Thecodiplosisjaponensis和雪蚤Hypogastrura harveyi中纯化出了天然抗冻蛋白，常用技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、高效液相色谱HPLC以及

5、快速蛋白液相色谱FPLC等。Graham等人采用Sephadex凝胶过滤层析和反相HPLC首次从黄粉虫血淋巴中纯化得到ug级的高活性8.4 kDa TmAFP。Lieu等人又进一步完善了TmAFP的提取方法，采用Sephacry凝胶过滤层析进行初步分离后，进一步采用反相HPLC半制备型和分析型C18柱分离纯化获得了一系列具热滞活性的同系物。HPLC是目前分离昆虫AFP的常用方法，DAFP和CfAFP也均采用该种方法进行分离。但Kristiansena等人研究发现该法对松皮天牛幼虫血淋巴中AFP（RiAFP）的分离纯化不适用，可能的原因是洗脱过程引起蛋白质空间构像的改变，从而使大部分蛋白失活。他

6、们采用热变性和三氯乙酸沉淀的方法对血淋巴进行预处理，粗提液经阳离子交换层析分离，再进一步用凝胶过滤层析纯化得到了至少6种分子量在12.512.8 kD之间的RiAFP。Marshall等人采用SephadexG75凝胶过滤层析对冬鲽Pseudopleuronectes americanus的血浆进行初步分离，收集前期有热滞活性的分离物进行冰亲和纯化（ice affinity purificmion，lAP），再用DEAE一纤维素阴离子交换层析分离得到了17 kDa的高活性抗冻蛋白。冰亲和纯化是利用AFP对冰的吸附作用，生长的冰晶会将它选择性地包裹从而实现分离。Gauthier等人也采用冰亲和纯

7、化的方法从黄尾鲽Limandaferruginea和美洲欧蝶Hipl,poglossoides platessoides血液中分离得到2种具高热滞活性的AFP。这种分离方法对AFP有较高的特异性，可以考虑应用于昆虫AFP的纯化。1.2昆虫抗冻蛋白分离纯化的来源材料 目前，昆虫天然抗冻蛋白的分离纯化有2个主要来源。从血淋巴中分离是来源之一也是最主要的途径。昆虫抗冻蛋白主要由脂肪体合成，经分泌、运输进入血淋巴行使功能，因此，血淋巴中含有相对丰富的抗冻蛋白。对昆虫抗冻蛋白的研究最初都是通过检测血淋巴是否存在热滞活性来推断抗冻蛋白的存在。上述TmAFP、DAFP、CfAFP和RiAFP均实现了从血淋巴

8、中的分离。然而，由于虫体中血淋巴含量较少，受虫体大小、不同发育阶段及种类的影响，从血淋巴中分离抗冻蛋白要求的样本数量一般较大。昆虫虫体也可以直接作为抗冻蛋白分离的材料。难以采集血淋巴的微小昆虫多采用该方法。Li等人以日本松针瘿蚊越冬3龄幼虫为材料，采用乙醇沉淀，三氯乙酸处理后经阴离子交换层析（DEAEsephadex A25）和凝胶过滤层析（sephadex G100）分离纯化得到2种抗冻蛋白，分子量分别是34.9和37.8 kDa。Graham等人也以雪蚤成虫虫体为材料分离纯化出2种抗冻蛋白。Wu等分别采用赤翅甲幼虫血淋巴和虫体作材料纯化AFP，虫体经匀浆，乙醇沉淀、透析及DEAESepha

9、roseCL6B阴离子交换层 析的预处理后采用与血淋巴中抗冻蛋白分离纯化相同的方法，即经凝胶过滤层析后采用反相高效色谱最终分离得到了与血淋巴中相同的4种抗冻蛋白。但随后的研究发现，昆虫抗冻蛋白不仅存在与血淋巴中，在肠液和表皮下的上皮细胞中也有存在。在对不同组织部位AFP的特定表达研究中，中肠、后肠肠液以及上皮细胞常被选作AFP的分离材料。Duman等人对赤翅甲不同组织部位的抗冻蛋白分析发现，尽管所有DAFP同系物基因在脂肪体均有转录，但在不同的组织部位DAFP的类型却有所差别，在血淋巴中只能分离检测到4种DAFP，其它类型则出现在中肠肠液和上皮细胞中。研究结果不仅暗示不同的抗冻蛋白在特定组织中

10、起着不同的作用，而且也提示我们血淋巴中提取的抗冻蛋白不能代表全部的抗冻蛋白，以全虫为材料提取的抗冻蛋白种类可能会更多。但由于昆虫抗冻蛋白的分子量较小（TmAFP为8.410.8 kDa，CfAFP约为9 kDa，DAFP为7.48.7 kDa，SfAFP为6.5和15.7 kDa），而且含量非常低，从虫体中分离，需经复杂的预处理步骤，即在不影响抗冻蛋白活性的前提下，大量去除比血淋巴中多得多的杂蛋白，然后再进一步纯化，这个过程中可能会造成部分含量甚微的抗冻蛋白损失而无法被检测出来。因此，在昆虫样本较多的条件下，多数会选择血淋巴作为抗冻蛋白提取的材料来源。目前，多数昆虫抗冻蛋白的编码基因实现了克隆

11、，并成功进行了原核或真核表达。许多原核表达的重组蛋白与天然蛋白的性质及结构差别不大，因此在对抗冻蛋白进行结构和功能的研究中可以直接采用重组蛋白替代天然蛋白。2昆虫抗冻蛋白的特性 2.1超强的抗冻活性 在生理状态下，昆虫抗冻蛋白可以把血淋巴的冰点降低5甚至更多，而一般鱼类抗冻蛋白只能把体液冰点降低1.5，昆虫抗冻蛋白具有比鱼类抗冻蛋白更高的热滞活性。黄粉虫的8.4 kDa TmAFP在gmol级浓度时，其热滞活性高达5.5，是多数鱼类抗冻蛋白热滞活性的10100倍；云杉卷叶蛾的9 kDaCfAFP337其热滞活性可达到10；而赤翅甲抗冻蛋白DAFP1热滞活性也在36之间；雪蚤的2种抗冻蛋白SfA

12、FP在umol浓度时，热滞活性均大于2。重组昆虫抗冻蛋白的热滞活性也比鱼类的高。作为例外，Marshall在极地鱼美洲拟鲽（Pleurortectesarnericantts）中发现的高活性抗冻蛋白其热滞活性可与昆虫AFP相媲美。与一般的鱼类AFP相比，昆虫AFP较高的热滞活性并不取决于它们与冰晶结合的亲和力高低，而是与抑制冰晶生长部位，重复出现的规则平面型的冰结合表面柏。及特殊的一级结构中氨基酸重复单位所形成的螺圈数有关。此外，Duman在对北极和阿拉斯加的多种昆虫研究中发现，一些能够在-40-70生存的耐冻昆虫也产生AFP，这些AFP的重结晶抑制作用可能比热滞效应更为重要。因为重结晶抑制作

13、用比冰晶生长的抑制作用更容易达到和控制，只需少量的AFP就能产生较高的重结晶抑制活性，从而避免冰晶对细胞组织的伤害。2.2规则的一级结构 昆虫抗冻蛋白多为小分子物质，具有独特的螺旋结构，虽然不同的抗冻蛋白氨基酸序列和组成不同，但一级结构具有高度的规律性，是目前发现的结构最规则的蛋白。TmAFP均富含Cys和Thr，一级结构包含多个串联重复的由12个氨基酸残基（TCTXSXXCXXAX）组成的重复单位，空间折叠形成右手一螺旋结构，分子内形成多个二硫键，而氨基酸重复单位在螺旋内形成环状结构。DAFP与8.4 kDa TmAFP在氨基酸序列上有很高的同源性，亦富含半胱氨酸，氨基酸重复序列由12或13

14、个氨基酸残基组成（CTXSXXCXXAXTX）。CfAFP的氨基酸序列与前2种AFP的同源性很低，分子内只含有8个半胱氨酸，氨基酸重复序列由15个氨基酸残基组成，空间结构为左手螺旋（封二彩版：图1A，B）。SfAFP（6.5 kDa）由81个氨基酸残基构成，富含Gly和Ala，4个Cys参与2个二硫键的形成。含特殊的三肽重复序列GlyX1X2，X1常为Gly，X2则可以是带电荷，亲水侧链的氨基酸残基或小，疏水侧链氨基酸残基如Ala/Val。理论模型推测分子是反平行片层结构，2个片层分别由3个平行一螺旋形成（封二彩版：图2a，b）。通过对3种研究得比较深入的昆虫抗冻蛋白的氨基酸序列特征和高级结构

15、等方面特性进行比较，发现很多关键的残基具有保守性，这些氨基酸可能在维持抗冻蛋白结构和功能的完整性中发挥着重要的作用。例如，在黄粉虫和赤翅甲的抗冻蛋白所有的半胱氨酸都是高度保守的，都参与二硫键的形成，形成稳定的蛋白结构。2.3相似的冰晶结合表面 目前，普遍接受的AFP与冰晶相互作用的机制是“吸附抑制”理论，即AFP特定的冰结合表面（ice binding surface，IBS）与冰晶吸附结合，由于Kelvin效应抑制冰晶生长，降低溶液冰点。TmAFP和CfAFP的冰结合表面都具有重复的TXT基序，通过晶体结构分析和冰冻蚀刻实验及冰晶形态学实验证明，TXT基序均规则地分布在所形成螺圈的一个侧面，

16、能够与冰晶形成紧密的面对面的互补体。在二者的结合中Thr侧链以及水分子起着关键作用。DAFP氨基酸重复单位中的TCT（Thr-CysThr）基序亦参与形成冰晶结合表面，通过表面互补作用与冰晶结合。TXT基序并不是所有昆虫抗冻蛋白的必需结构，这可能是由于不同种类的昆虫对抗冻蛋白的要求不一样，有的昆虫是避免结冰的昆虫对热滞性要求高，而有的昆虫虽然也能够产生抗冻蛋白，但它们可以忍受胞间结冰，所以不含TXT基序的抗冻蛋白能够通过抑制重结晶使他们免受伤害。抗冻蛋白在食品的冷冻、储藏、运输和解冻过程中可以减少细胞损伤提高冷冻食品的质量，还可以作为食品添加剂，加入冰淇淋等冷冻食品中以改善其口感。在医学上抗冻蛋白可用于人和动物的卵、精子、胚胎、心脏或肝脏等器官的超低温保存，改善其冷冻质量。另外通过基因工程还可以进行转基因抗冻农作物的培育，增强作物在田间的抗寒能力的同时还会改善作物在收获后的贮藏加工特性。由于昆虫抗冻蛋白具有比植物和鱼类抗冻蛋白更高的热滞活性，随着对其结构、功能和作用机制研究的不断深入，相信昆虫抗冻蛋白必将在农业、医学和食品科学等领域具有更加广阔的应用前景。