微生物学教案 第九章 微生物基因表达的控制Word文件下载.docx

1、专一性的-蛋白质结合到特定序列的核酸部位。例如，组蛋白、鱼精蛋白，在维持真核生物染色体结构方面是非常重要的。组蛋白是一种含有较高正电荷氨基酸（精氨酸、赖氨酸、组氨酸） 的小分子量蛋白。DNA由于含有较高的负电荷磷酸基因，使其带负电荷。这些磷酸基团位于DNA双螺旋的外面。由于正负电荷基团的作用，组蛋白与DNA非专一性的强烈结合。在真核微生物细胞中的大量的组蛋白完全覆盖了DNA的磷酸基团。组蛋白与DNA的结合导致形成核小体 。这种相对而言非专一性的结合作用也能够影响基因表达。如果DNA被组蛋白所覆盖，其他蛋白，如RNA聚合酶就不能与DNA结合，转录作用将无法开始。也有很多蛋白质与DNA发生序列专一

2、性结合作用。这些蛋白质的氨基酸侧链与DNA的碱基、磷酸或戊糖分子发生结合。DNA的大沟（major groove）由于其大小适当，是蛋白质结合的重要位置。为了实现专一性结合，蛋白质必须与一种以上，通常是多种核酸碱基同时作用。DNA的反向重复结构处常常是蛋白质分子专一性结合的位点。与DNA发生特异结合的蛋白质通常是由两条相同多肽链组成的二聚体。每一条多肽链有一个部位与DNA大沟的一个区域发生特异作用。这样，蛋白质二聚体的每一条多肽链将与双链DNA中的一条发生序列专一性结合，例乳糖操纵子操纵区的核苷酸序列的反向重复结构是阻遏蛋白二聚体的结合部位。2.DNA结合蛋白质的结构 研究表明，无论原核还是真

3、核生物中DNA结合蛋白有几种共同的结构形式，这些形式对于蛋白质准确地与DNA相结合是非常关键的。形式之一是被称为螺旋-转角-螺旋（helix-turn-h elix）的结构（简称HTH，见图9-1）。HTH的一端是由氨基酸形成的螺旋次级结构，又称为识别螺旋，它与一个由三个氨基酸组成的转角相连接。的另一端与第二个螺旋相接。第二个螺旋通过疏水相互作用稳定第一螺旋。结合蛋白与DNA碱基对之间通过氢键及范德华氏引力的非共价结合作用进行DNA特异序列识别。许多来自细菌的不同的DNA结合蛋白显示出螺旋-转角-螺旋结构，包括许多阻遏蛋白，例如噬菌体阻遏蛋白及大肠杆菌Lac和Trp阻遏蛋白等。图9-1DNA结

4、合蛋白的螺旋-转角-螺旋（HTH）结构DNA结合蛋白中还有另外两种常见的形式。锌指（Zinc finger）是常见于真核调节蛋白的一种形式。锌指如同其名称是一种含锌离子的蛋白亚结构（图9-2）。其特点是通过锌离子把四个氨基酸（二个组氨酸，二个半胱氨酸）连在一起，利用锌离子相连的由氨基酸以螺旋形式形成的指在大沟中与DNA相互作用。在蛋白质与DNA的结合作用中蛋白质上至少存在两种这样的。DNA结合蛋白中常见的另一种亚结构称为亮氨酸拉扣（leucine zipper） 。这一亚结构由每隔七个氨基酸就有一个亮氨酸残基的侧链形成，这个结构有点象拉链。不同于螺旋-转角-螺旋和锌指，本身不与DNA作用，而是

5、保持另外两个螺旋在正确的位置与DNA结合（图9-3）。图9-2锌指蛋白结构；图9-3亮氨酸拉扣蛋白质结构二、操纵子的转录调控 原核生物细胞中，功能相关的基因组成操纵子结构，由操纵区同一个或几个结构基因联合起来，形成一个在结构上、功能上协同作用的整体-操纵子（operon），受同一调节基因和启动区的调控。调节基因通过产生阻遏物或激活物来调节操纵区，从而控制结构基因的功能。启动子是RNA聚合酶和CAP蛋白的结合位点，控制着转录的起始。这样，这些基因形成了一整套调节控制机制，才使生命系统在功能上是有序和开放的。原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，这是一种最为经济的调控。根据调控机制的不同又可分为

6、负转录调控（negative transcription control）和正转录调控（positive transc ription control）。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。根据其作用性质又可分为负控诱导和负控阻遏二大类，在负控诱导系统中，阻遏蛋白不和效应物（诱导物）结合时，阻止结构基因转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白和效应物（有阻遏作用的代谢产物，辅阻遏物）结合时阻止结构基因的转录。阻遏蛋白作用的部位是操纵区。在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator protein）。 同样也可根据激活蛋白的

7、作用性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的 存在使激活蛋白处于活动状态；在正控阻遏系统中，效应物分子（有阻遏作用的代谢产物， 抑制物）的存在使激活蛋白处于不活动状态。该系统目前缺乏典型的例子，本章从略。不论是诱导系统还是阻遏系统，激活蛋白的作用部位不是操纵区而是离启动区很近的激活结合位点（activator binding site），对启动区起正的作用（图9-4）。1.负控诱导系统 大肠杆菌的lac i基因与乳糖操纵子（lactose operon）的作用是典型的负控诱导系统。在这个系统中，i基因是调节基因，当它的产物-阻遏蛋白与操纵区（lacO）结合时

8、，RNA聚合酶便不能转录结构基因，因此，在环境中缺乏诱导物（乳糖或IPTG）时，乳糖操纵子是受阻的。而当环境中存在有乳糖时，进入细胞的乳糖在细胞内尚存在的极少量的-半乳糖苷酶的作用下而发生分子重排，由乳糖（galactose -1,4-glucose）变成异乳糖（alloactoes, galactose -1,6-glucose），异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白紧密结合，使后者的构型发生改变而不能识别 lacO，也不能与之结合，因而RNA聚合酶能顺利转录结构基因，形成大分子的多顺反子 mRNA（polycistronic mRNA），继而在翻译水平上合成三种不同的蛋白质：-半乳糖苷酶、透性酶以及

9、乙酰基转移酶（图9-5）。图9-4细菌的转录调控系统图9-5 大肠杆菌中，lac i 基因对乳糖操纵子的调控2.负控阻遏系统 大肠杆菌色氨酸操纵子（tryptophan operon）含有5个结构基因，编码色氨酸生物合成途径中的各种酶。这些基因从一个启动子起始转录出一条多顺反子的mRNA，与lac操纵子一样，这个启动子受毗邻的操纵区顺序控制。转录是通过操纵区和阻遏蛋白控制的，它的效应物分子是色氨酸，也就是由trp操纵子的基因所编码的生物合成途径中的末端产物。当色氨酸很丰富时，它结合到游离的阻遏物上诱发变构转换，从而使阻遏物紧紧结合在操纵区。另一方面，当色氨酸供应不足时，阻遏物失去了所结合的色氨

10、酸，从操纵区上解离下来，trp操纵子的转录就此开始。色氨酸起着trp操纵子的辅阻遏物（corepressor）功能。随着对色氨酸操纵子的深入研究，发现有些现象与以阻遏作为唯一调节机制的观点不相一致 ，例如，在色氨酸高浓度和低浓度下观察到trp操纵子的表达水平相差约600倍，然而阻遏作用只可以使转录减少70倍，此外，阻遏物失活的突变不能完全消除色氨酸对trp操纵子表达的影响。没有阻遏物时，在培养基中含或不含色氨酸的条件下观察到转录速度相差810倍 。显然操纵子表达的这种控制与阻遏物的控制无关，必然还有其它的调控机制，这种调控机制主要是通过缺失突变株的研究而发现的，称为弱化作用（attenuati

11、on）。弱化作用是细菌辅助阻遏作用的一种精细调控。这一调控作用通过操纵子的前导区内类似于终止子结构的一段DNA序列而实现，它编码一条末端含有多个色氨酸的多肽链-先导肽，被称为弱化子。当细胞内某种氨基酰 tRNA缺乏时，该弱化子不表现终止子功能；当细胞内某种氨酰 tRNA足够时该弱化子表现终止功能，从而达到基因表达调控的目的，不过这种终止作用并不使正在转录中的mRNA全部都中途终止，而是仅有部分中途停止转录，所以称为弱化。这便是在trp操纵子中所发现的除阻遏作用以外的另一种调节功能。图9-6中的示意图解释了怎样通过前导肽的翻译来控制转录。当色氨酸缺乏时，tRNAtrp也缺乏，前导肽不被翻译，核糖

12、体在两个相邻的色氨酸密码子处停止，阻止了12配对， 而使23配对，因此不能形成34配对的茎环终止子结构，将RNA聚合酶放行越过先导区进入结构基因，结果导致操纵子表达。如果色氨酸过量，则可得到tRNAtrp，前导肽被翻译使核糖体通过色氨酸密码子的位置，前导肽被正常翻译，核糖体阻止23配对导致3 4配对，终止信号出现，从而导致转录在尿苷残基顺序上中断。图9-6色氨酸操纵子的弱化作用模型3.正控诱导系统 在正控诱导系统中，调节蛋白为激活蛋白，促进RNA聚合酶的结合，从而增加mRNA的合成。大肠杆菌麦芽糖操纵子（maltose operon）的调控是典型的例子，这里麦芽糖是诱导物，激活蛋白只有与麦芽糖

13、结合时才能与DNA的特殊结合位点结合，促使RNA聚合酶开始转录（图9-7），该结合位点称为激活蛋白结合位点，与启动区毗邻或在相隔几百个碱基对处。图9-7麦芽糖正控诱导系统三、分解代谢物阻遏调控 分解代谢物阻遏又被称为葡萄糖效应，这是因为葡萄糖是首先被发现具有这种阻遏效应的物质。当培养基含有多种能源物质时，微生物首先利用更易于分解利用的能源物质，而首先被利用的这种物质的分解对利用其他能源性物质的酶的产生有阻遏作用。分解代谢物阻遏是如何进行的呢? 分解代谢物阻遏涉及一种激活蛋白对转录作用的调控。分解代谢物阻遏中，只有当一种称为分解物激活蛋白（CAP）首先结合到启动子上游后，RNA聚合酶才能与启动基

14、因结合。这种激活蛋白是一种变构蛋白，当它与cAMP结合后构象发生变化，这时才能与DNA结合并促进RNA聚合酶的结合。无论在原核生物或高等生物中cAMP都是多种调控系统的重要因素。cAMP由腺苷酸环化酶催化ATP而产生，葡萄糖能抑制cAMP形成并促进cAMP分泌到胞外。葡萄糖进入细胞后，胞内的cAMP水平下降，RNA聚合酶不能与启动子结合。因此，分解代谢物阻遏实际上是cAMP缺少的结果。如果在培养基中补充cAMP，上述阻遏现象可以被抵消。在许多不涉及分解代谢物阻遏的真核生物中cAMP具有其他调节作用；在某些粘菌中cAMP还是聚集过程的一种胞外信号。事实上，凡是在降解过程中能被转化成葡萄糖或糖酵

15、解途径中的其他中间产物的糖代谢（如乳糖、半乳糖、麦芽糖、阿拉糖等）中，其有关的酶都是由可诱导的操纵子控制的。只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不表达，被称为降解物敏感型操纵子（catabolite sensitive operon）。实验证实，这些操纵子都是由cAMP-CAP调节的 。cAMP-CAP复合物是一个不同于阻遏物的正调控因子，从这个意义上讲，前面提到的乳糖操 纵子的功能是在正、负两个相互独立的调控体系作用下实现的。四、细菌的应急反应 当细菌处于一种氨基酸全面匮乏的氨基酸饥饿状态时，细菌会采取一种应急反应以求生存，即停止包括各种RNA（特别是rRNA）在内的几乎全部生物化学反应过程，只保

16、持维持生命 最低限量的需要。实施这一应急反应的信号，是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），产生这二种物质的诱导物是空载tRNA。当氨基酸缺乏时，导致出现空载tRNA，这种空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急情况。关于ppGpp和pppGpp 的作用原理还不十分清楚，目前认为有二种可能：（1）ppGpp与RNA聚合酶结合，使后者构型发生改变，从而识别不同的启动子，改变基因转录的效率，或关闭，或减弱，或增加；（2）ppGpp与启动子结合，使后者不再与RNA聚合

17、酶结合，导致基因被关闭。实际上这二种作用都将是导致某些重要的启动子的关闭或开启某些弱启动子。例如大肠杆菌的rRNA的操纵子（rrnE） 上有两个启动子P1和P2（图9-8）。细菌在对数生长期时，P1起始的转录产物比P2大3-5倍，所以P1是强启动子。但是当细菌处于氨基酸饥饿的紧急状态时，细胞内ppGpp浓度增加，这时P1的作用被抑制，由P2启动少量的rRNA的合成，以维持生命的最低需要。图9-8大肠杆菌rrnE上的两个启动子（P1，P2）受ppGpp浓度的调控这里，也可能是ppGpp使RNA聚合酶构型发生变化不识别P1而识别P2；也可能是ppGpp与P1结合，从而导致其关闭。ppGpp的作用范

18、围十分广，它不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，也不只是调控转录而是也调控翻译。所以它们是超级调控因子。五、通过因子更换的调控1.枯草杆菌芽孢形成过程中的因子的更换 枯草杆菌在不利生长的条件下会产生芽孢，芽孢的形成过程十分复杂，至少有6个因子和80多个基因参与。因子（sigma factor）是RNA聚合酶核心酶与启动子之间的桥梁，参与启动子的识别和结合 ，枯草杆菌通过有序的因子更换，使RNA聚合酶识别不同基因的启动子，使与孢子形成有关的基因有序地表达。就目前已发现的亚基来说，其更迭次序为55、28、32、37和29。含有55的RNA聚合酶只能识别营养生长阶段的基因启动区，当营养耗竭，

19、细胞处于饥饿的状态下，含有28的RNA聚合酶则负责转录那些能够探测营养耗竭和起始孢子形成反应的基因。28则是孢子形成的信号系统。32和37则是负责识别早期孢子形成基因的启动子。含有29的RNA聚合酶则负责中、晚期孢子形成基因的转录。此外，还有二种亚基gp28和gp3334也是负责中、晚期基因的表达。以上这些亚基都能够识别特定的启动子。55所识别的启动子具有与大肠杆菌相似的10和35序列，而其它亚基都有各自的启动子结构特征。2.大肠杆菌的热激应答大肠杆菌在通常情况下，只有一种亚基，没有象枯草杆菌那样的亚基更换现象。但是，如果让大肠杆菌生长在较高的温度下（如4250），某些基因则迅速表达，诱导产生

20、热激蛋白，这种现象称为热激应答反应（heat shock response）。这是目前已知的最保守的遗传系统，存在于每一种生物体内，包括从古生菌到真细菌，从植物到动物。在热激应答反应的传感蛋白可能是HSP70蛋白，它本身是一种热激蛋白，感受温度变化后调节热激应答系统的调节蛋白基因rPOH（过去称为htpR）的表达，该基因的产物RpOH是一种分子量为32000道尔顿的次级因子，称为32。由32参与构成的RNA聚合酶全酶能够识别热激应答基因的启动子；由32识别的这类基因的启动子与标准因子（0）所识别的启动子不同。在其-35序列的前面还有几个保守的碱基（TNNCNCNC），-10序列前面有保守的CC

21、CC。当细菌适应了较高生长温度时，大多数热激应答基因便停止（如大肠杆菌在42经过20分钟），又开始表达常规基因。其转换机制，目前还不清楚。已知在热激应答反应时，细胞内蛋白质降解速度急剧增加，其中可能包括70的降解。在正常情况下，70基因作为操纵子（包括S21基因、DNA引发酶基因和70基因）的一部分而转录多基因的mRNA，然而70基因本身还有一个热激应答启动子，位于其前一个基因（DNA 引发酶基因）内（图9-9），尽管热激应答反应并不需要70，但70基因在热激应答反应中仍大量表达，这一情况可能与细菌适应较高温度后开始表达基因有关 。细胞在不利条件下仍然要为恢复正常秩序作好准备。图9-9 亚基操

22、纵子的启动子（P1、P2）和70基因的热激应答启动子（PHS）六、信号传导和二组分调节系统细胞生活在不断变化的环境中，包括温度、pH和渗透压在内的变化，氧的可利用性，营养的变化，乃至细胞浓度的变化等都将使细菌必须随时作出相应的反应和调节以求生存。前面讨论的诱导和阻遏转录调控系统中均是通过环境中的小分子效应物（诱导物或阻遏物）直接与调节蛋白结合进行转录调控，但是在较多情况下，外部信号并不是直接传递给调节蛋白，而是首先通过传感器（senor）检测到信号，然后以变化的形式传到调节部位，将这一过程称为信号传导（signal transduction）。目前已知的最简单的细胞信号系统称二组分系统（two

23、 component systems），由二种不同的蛋白质组成：（1）位于细胞质膜上的传感蛋白（sensor prot ein），因该蛋白质具有激酶活性，所以又称传感激酶；（2）应答调节蛋白（response regulat or protein），位于细胞质中。传感激酶在与膜外环境的信号反应过程中，本身磷酸化，磷酰基团然后被转移到应答调节蛋白上，磷酸化的应答调节蛋白即成为阻遏蛋白。该阻遏蛋白再通过其对操纵子的阻遏作用进行调控。从图9-10中可以看出在该系统中必须有磷酸酶参入，以移去应答调节蛋白磷酸基因。图9-10二组分调节系统 目前已知二组分系统在许多不同细菌中调节大量的基因，例如大肠杆菌中

24、氮的吸收，根瘤菌中氮的固定，芽孢杆菌中芽孢的形成等。据初步估计，大肠杆菌中至少有50种不同的二组分系统。现在在低等真核生物中（如酿酒酵母）也发现了这类调节系统。二组分调控系统对细菌的某些行为也具调控作用。我们知道细菌对某些特殊的化学药物具有趋向或逃离的行为，通常将其称之为趋化性（chemotaxis）。细菌太小，以至于它们实际上无法感知空间存在的化学药物的浓度梯度，但是它们却能对随时改变的梯度具有十分灵敏的反应，这就是因为它们能够利用二组分调节系统感知细胞外面化学药物浓度的变化，并调节鞭毛的运动。细菌在没有化学药物浓度梯度的环境中，其运动方向是随机的，一般是向前直线运动几秒钟就停下来翻筋斗，然

25、后再又以不同的方向作直线运动，循环往复（图9-11，a）。当细菌处在 有引诱物（如营养物等）梯度的环境中时，翻筋斗频率减少，向引诱物高浓度区作直线运动的时间延长（图9-11，b）。但如果向低浓度区移动，则翻筋斗频率不减少。其运动方向的综合效应是细菌向高浓度的引诱物运动。如果细菌处于有毒物质浓度梯度的环境中则出现相反的应答反应，即细菌向低浓度毒梯度作直线运动时间延长，翻筋斗频率减低。图9-11细菌的趋向运动细菌的这种趋化性运动是如何调控的呢? 从图9-12可以看出，一种称为接受甲基趋化性蛋白（ methyl accepting chemotaxis proteins, 简称MCPs）是受体蛋白。

26、二组份系统中的传感激酶是CheA。MCPs是跨膜蛋白，在细胞质这一边还与CheW和CheA蛋白结合成为复合物，当MCP未与引诱物结合时，该复合物刺激CheA自身磷酸化，进而再使CheY和CheB二个细胞质蛋白也磷酸化，形成CheY-P和CheB-P。CheY-P与鞭毛传动器结合，启动鞭毛顺时针旋转，细菌作翻筋斗运动。如果引诱物结合到MCP上，则CheA的自身磷酸化被抑制，CheY不能与鞭毛传动器结合，此时鞭毛逆时针旋转，细菌则进行直线运动。CheY的磷酸化由于CheZ蛋白的去磷酸化作用，只有很短10秒左右，使翻筋斗时间不至于太长，以便随时适应变化的环境。图9-12细菌的趋化性机制模式图细菌与引

27、诱物和毒物应答的能力还与MCPs的甲基化有关。CheR以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体以低频率不断地将甲基基团加到MCPs上，而另一蛋白CheB（具脱甲基酶活性）则可以从MCPs上去掉甲基。引诱物-MCPs复合物是CheR的合适作用基质而不适于CheB，所以当引诱物与MCP结合时，不仅仅是引起逆时针旋转并作直线运动，而且也降低了脱甲基酶活性，使MCP甲基化增加，导致构型发生变化，因此即使引诱物维持高水平但不再与MCPs结合，CheA-P的水平仍然增加，细胞又开始翻筋斗。失去引诱物结合的MCP，又将成为CheB的作用底物进行去甲基反应，去甲基的MCPs又能够再应答引诱物。所以细菌在向高浓度梯度引诱

28、物运动的过程中，直线运动和翻筋斗交替进行，但直线运动时间长，翻筋斗频率低，总的方向是趋向高浓度引诱物。七、噬菌体溶源化和裂解途径的转录调控 噬菌体感染宿主以后，有二种发育途径可供选择：一个是裂解途径，一个是溶源化途径。 这二条途径之间是如何进行调控的呢? 已知噬菌体基因组上大约有35个编码蛋白质的基因（ 图9-13），基因表达的调控通过左、右二个方向的转录进行。在大肠杆菌中一个操纵子是一个转录单位，每一个操纵子中包括功能上密切相关的几个基因。但噬菌体的一个转录单位包括功能上并不一定密切相关的基因，可以包括不止一个操纵子，但一个转录单位不管包括几个操纵子，都称为一个转录子。噬菌体感染宿主后最先转

29、录并合成一些调节蛋白，通过调节蛋白的作用，其它基因的转录或被激活或被阻遏，从而使它进入裂解或溶源途径。调节噬菌体转录的主要调节蛋白是CI和Cro，分别由cI基因和cro基因编码。CI蛋白对cro基因的转录起着负控制作用，对cI基因本身的转录则既有正控制又有负控制，Cro蛋白对cI基因和cro基因都起负控制作用。当噬菌体处于溶源化状态时，噬菌体DNA以原噬菌体形式整合在宿主细菌染色体上，只有cI基因表达，其表达产物CI蛋白首先与右边和左边的操纵区OR和OL结合，阻止右边和左边的启动子PR和PL的启动功能。另一方面由于CI蛋白占据了OR，抑制了cro基因转录，从而不利于右向转录（裂解），使整个噬菌

30、体基因组作为宿主细胞染色体的一部分，其复制和基因表达完全处在宿主染色体的控制之下。但由于cI基因是一种自我调节基因。当细胞内CI蛋白含量过高时，可阻止cI基因表达，所以溶源性状态下的噬菌体在不经诱导的情况下，也会以极低的频率进入裂解循环（此过程中也包含cI基因的自发突变而失去阻遏活性）。图9-13噬菌体基因组示意图当溶源菌（lysogenic bacteria, 即染色体上含有原噬菌体DNA的宿主菌）受到紫外线等因素作用时，由于DNA上造成损伤，RecA蛋白具有切割阻遏蛋白的活性（见SOS修复），使CI蛋白被切割，亚基被破坏，CI蛋白从DNA上脱落，于是RNA聚合酶便有机会与cro基因的启动子结合，表达Cro蛋白，使转录向裂解方向进