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1、中国芽胞杆菌的资源也十分丰富（刘国红等，2008），遗憾地是系统从事芽胞杆菌属资源分类和系统发育等研究的科研单位较少，保存的芽胞杆菌种类标准菌株十分缺乏，严重地影响了我国芽胞杆菌资源分类与系统发育的研究。芽胞杆菌的功能与应用。芽胞杆菌可以产生多种多样的活性物质，在工业、农业、医学、环境等领域有着重要的经济价值。芽胞杆菌可以用于生产工业原料（如丙二醇等）（Wu et al.，2007）、医药卫生（如二酮哌嗪等）（Yonezawa et al.，2011）、食品加工（如环糊精）（Zhekoval et al.，2011）、生物农药（Korenblum et al.，2005；郑雪芳等，2006；L

2、iu et al.，2006；Zhuang et al.，2011）、生物肥料（Perez-Garcia et al.，2011）、生物保鲜剂（如龙眼短短芽胞杆菌保鲜菌）（车建美等，2010，2011；Morsi et al.，2010）、饲用益生菌（陈璐等，2009；Ripamonti et al.，2011）、环境生物修复剂（Mnif et al.，2011）、畜禽粪便降解剂（如凝结芽胞杆菌猪粪降解菌）（刘波等，2008，2009；Marti et al.，2011）、水质生物净化剂（Sanjoy et al.，2010）等。到目前为止，农业微生物活菌制剂90%来自于芽胞杆菌（Tyurin

3、 et al.，2006）。同时，芽胞杆菌也是一种模式微生物，在生物学、生态学、生理学、分子生物学、病理学、基因组学、蛋白组学、转录组学、代谢组学等领域具有重要的研究意义（Segerman et al.，2011）。芽胞杆菌系统分类研究进展。鉴于芽胞杆菌的重要研究性和应用价值，发达国家如德国、美国、法国、英国、比利时、日本等已建立了完善的资源收集和研究体系（Sikorski，2008；Meites et al.，2010）。丰富的种类标准菌株资源，为芽胞杆菌新种的鉴定和分类体系的研究提供了重要的基础作用（Tindall，2000）。德国的菌种保存中心（DSMZ）保存收集了完整的芽胞杆菌属（Ba

4、cillus）模式种179种，芽胞杆菌近缘属48属231种。近10年来（2001-2011），全世界发表的芽胞杆菌属新种共135种；大多数新种发表者来自发达国家，欧美国家发表了62种，占总数的45.9%；韩国发表了24种，占17.8%；日本发表了17种，占12.5%；我国发表了14种，占10%；印度发表了10种，占7.4%，其他国家发表了8种，仅占5.9%（刘国红等，2011）。尽管我国在IJSEM上也发表了一些新种，但作为微生物学基础研究的重要领域，专业从事分类相关的实验室和研究人员却很少。据周宇光（2007）主编的中国菌种目录记载，保存在中国各大保藏中心的芽胞杆菌属种类种类标准菌株仅25种

5、，这些数量与国外保存的芽胞杆菌属种类标准菌株179种相比，对于中国芽胞杆菌资源分类和系统发育研究来说是远远不够的。基于芽胞杆菌属全基因组精细图绘制与分子系统发育分析研究的提出芽胞杆菌存在着生理分化的生态适应性，芽胞杆菌具有嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热、嗜金属、好氧、厌氧、耐高压、耐低压等生理分化和生态适应性，在地球的各种极端条件下都有分布。目前，芽胞杆菌种类鉴定和分类系统主要还是采用多相分类法，包括了形态特征、生理生化、16S rRNA、脂肪酸组成（PLFA）、细胞壁组成、DNA-DNA杂交等。在一般情况下一种芽胞杆菌与其最靠近的已知芽胞杆菌的16S rRNA相似性小于98%，DNA-DNA杂

6、交相似性小于70%，可定义为新种。因而，一个芽胞杆菌鉴定过程非常复杂繁琐，特别是DNA-DNA杂交，作为芽胞杆菌鉴定的标准，检测技术复杂、费用高。申请者利用华大基因研究院的新一代高通量全基因组测序技术，其成本和DNA-DNA杂交成本相差无几（每个芽胞杆菌在DNA自行提取的条件下，全基因组测序的费用在5千元左右），可以高效、低成本地完成芽胞杆菌物种全基因组序列图谱。利用芽胞杆菌种类全基因组序列，计算core genes的ANI（平均核苷酸一致性），与作为种鉴定的标准DNA-DNA杂交相似性值进行比较，建立相关模型，用ANI值替代DNA-DNA杂交，作为芽胞杆菌种类鉴定的标准。这样，在低成本下获得

7、芽胞杆菌种类全基因组序列，不仅可以提取16S rRNA序列作为芽胞杆菌属以上分类单元鉴定分类标准；同时可以计算ANI值作为替代DNA-DNA杂交相似性值，作为种类鉴定分类标准，实现基于全基因组的芽胞杆菌种类网络比对鉴定系统，大大提高芽胞杆菌种类鉴定效率；还可用于芽胞杆菌生理分化的遗传机制分析，研究芽胞杆菌属的分子系统发育。选择芽胞杆菌属的生理分化（如嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热等特性）基因序列特征，利用多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST），重新对芽胞杆菌属的分化进行研究，使得芽胞杆菌属的分子系统发育与生物学特性紧密关联，建立一个符合逻辑的芽胞杆菌系统

8、分类体系。本研究拟解决的科学问题是：“芽胞杆菌属全基因组精细图的测定，基于基因组core genes的ANI（平均核苷酸一致性）的网络比对鉴定模型和芽胞杆菌生理分化功能基因（簇）的多位点序列分型（MLST）分子系统发育分析”。围绕基于全基因组的芽胞杆菌种类网络比对鉴定系统建立和生理分化相关的多位点序列分型分子系统发育分析，申请者提出“基于全基因组芽胞杆菌属分类及分子系统发育研究”，并作了大量的前期研究准备工作。利用申请者作为访问学者和博士生导师与德国波恩大学植物病理研究所Sengonca教授建立了长达20多年（1992-2013年）的合作关系，已经从德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）引进芽胞杆

9、菌属种类标准菌株160种，占芽胞杆菌属种类标准菌株总数的89.3%，还将继续引进，较为完整的芽胞杆菌属种类标准菌株体系（179种，除了部分高致病性芽胞杆菌外），使得国内芽胞杆菌属种类标准菌株保存水平达到了一个新的高度与国际接轨，为本项目的研究打下坚实的基础。研究利用收集到的芽胞杆菌属160种标准菌株，进行全属芽胞杆菌种的全基因组测序。利用芽胞杆菌种类全基因组序列，计算core genes的ANI（平均氨基酸一致性），与作为种鉴定的标准DNA-DNA杂交相似性值进行比较，建立相关模型，用ANI值替代DNA-DNA杂交，作为芽胞杆菌种类鉴定的标准。还可用于芽胞杆菌生理分化的功能基因与遗传机制分析，

10、研究芽胞杆菌属的分子系统发育。选择芽胞杆菌属的生理分化（嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热、嗜金属、好氧、厌氧、耐高压、耐低压等）基因序列特征，利用多位点序列分型（MLST），重新对芽胞杆菌属生理分化的系统发育进行研究，使得芽胞杆菌属的分子系统发育与生物学特性紧密相关，建立一个符合逻辑的芽胞杆菌分子系统发育体系，研究我国芽胞杆菌属资源生态分布多样性与系统进化，为挖掘我国芽胞杆菌功能基因资源和种类资源，发现新基因、新纪录或新种提供条件，为我国芽胞杆菌理论研究和实际应用奠定科学基础。申请者研究基础。近15年来致力于芽胞杆菌资源采集、保存、鉴定、分类和功能开发，在中国大陆除了湖北、重庆、贵州外的30个省（

11、市、自治区）采集和保存了不同地理、不同生境的芽胞杆菌土壤样本8400多份，分离到芽胞杆菌属的菌株16000余株，已经从德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）引进芽胞杆菌属种类标准菌株160种，占芽胞杆菌属种类标准菌株总数的89.3%。将继续进行芽胞杆菌全国范围内的系统采样和标准菌株的引进。为中国芽胞杆菌资源收集、保存、鉴定、分类和新种的发现创造条件；申请者研究团队掌握了芽胞杆菌多相分类方法的技术体系，且拥有进行芽胞杆菌分离培养、形态观察、生理生化鉴定、16S rRNA序列测定、DNA-DNA杂交、脂肪酸分类鉴定的技术体系所需的装备；利用引进的芽胞杆菌属种类标准菌株，对国内采集芽胞杆菌资源进行鉴定和

12、多相分类，整理中国芽胞杆属的种类，力图发现中国芽胞杆菌的新种；测定较为完整的芽胞杆菌属种种类标准菌株的脂肪酸生物标记，补充美国MIDI公司建立的仅有50多种芽胞杆菌种类标准菌株的脂肪酸生物标记的不足，形成完整的具有160种的芽胞杆菌种类脂肪酸自动鉴定系统，加速我国芽胞杆菌资源鉴定分类的研究；同时进行以芽胞杆菌脂肪酸生物标记为基础的系统发育研究，与16S rRNA相比较，结合生物学研究，提出芽胞杆菌脂肪酸系统发育的新观点-脂肪酸系统发育分群，分析我国芽胞杆菌属种类生态分布、群落结构、种群分化的系统发育。开发出了一批芽胞杆菌生物农药、生物肥料、动物益生菌等，应用于农业生产。本项目的研究前景。将建立

13、一个基于全基因组测序的芽胞杆菌种类网络比对鉴定系统，并将所有数据上网公开，提供芽胞杆菌种类全基因组比对鉴定软件，为自助鉴定服务，同时形成芽胞杆菌生理分化的分子系统发育分类系统，填补国际上芽胞杆菌系统分类的空白。对中国采集典型样本的芽胞杆菌菌株进行全基因组测序和种类鉴定，整理我国芽胞杆菌资源分类，力图发现新种或新记录，为挖掘芽胞杆菌功能基因和功能菌株提供基础，在科学上和应用上具有重要意义。1.2国内外芽胞杆菌属的研究现状及发展动态芽胞杆菌属建立与分类。Ehrenberg（1835）命名和描述了Vibrio subtilis作为浸液微生物（Infusoria）（纤毛虫）的一个种。Davaine等（

14、1864）在显微观察炭疽病致死的动物血液中的寄生虫时发现炭疽病是可以从死亡的动物血液中相互传染的，定名为Bacteridium。1870年Pasteur在研究蚕病时，在蚕软腐病（Flacherie）死亡的昆虫中，明显地观察到内生芽胞，发现了内生芽胞的细菌。直到Cohn（1872）提出芽胞杆菌属（Bacillus），其分类地位才固定下来，将Vibrio subtilis定为该属的种类标准菌株，并重新命名为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis。1877年Cohn描述了B. subtilis的芽胞，证明了芽胞的抗热性。1877年Koch提出了炭疽芽胞杆菌Bacillus anthracis

15、的细胞生长循环，指出了细菌生长从细胞到抗热芽胞，再从抗热芽胞到细胞。Flgge（1891）第一个提出使用好气生长特性对Bacillus属进行分类。早期的分类学家把杆状的细菌均归结为Bacillus属，从而导致了这个属含有大量的种类，虽然在Topley and Wilson（1929）的著作“Principles of Bacteriology and Immunity”中，把这个属定义为好氧的、含有芽胞的杆菌、通常为革兰氏阳性，当时在这个属中大约有200多个种，但是，直到今天仍然有很多微生物学家认为这个属存在着巨大的多样性，是可以分化的（Lechevalier and Solotorovsky

16、，1965）。在细菌分类学研究上的3个重要的里程碑，对芽胞杆菌分类研究是非常重要的。第一个里程碑就是Dr. Robert S. Breed 1923年主持出版了伯杰氏鉴定细菌学手册（Bergeys Manual of Determinative Bacteriology），他从1913年到1946年是Cornell大学附属纽约农业试验站（Geneva）细菌学部的主任，承担了伯杰氏鉴定细菌学手册的第一版到第七版的主要编辑工作。第二个里程碑是Ruth Gordon研究芽胞杆菌属的工作，出版了著名著作“The Genus Bacillus”，是现代Bacillus分类学的基础。第三个里程碑是出版细菌

17、核准名称目录（Approved List of Bacterial Names）（Skerman et al.，1980）。伯杰氏鉴定细菌学手册的不同版本收录的芽胞杆菌属种类不同，第一版（1923）75种，第二版（1925）75种，第三版（1930）93种，第四版（1934）93种，第五版（1939）146种，第六版（1948）分化出多个芽胞杆菌近缘属，记述芽胞杆菌属33种，第七版（1957）分化出多个芽胞杆菌近缘属，记述芽胞杆菌属（Bacillus）25种，第八版（1974）分化出多个芽胞杆菌近缘属，记述芽胞杆菌属22种；1984-1986年间伯杰氏鉴定细菌学手册改名为伯杰氏系统细菌学手册（

18、Bergeys Manual of Systematic Bacteriology），1986年伯杰氏系统细菌学手册由美国Williams & Wilkins出版公司出版了第一版伯杰氏系统细菌学手册（1984-1989），分四卷出版；1994年又将伯杰氏系统细菌学手册1-4卷中有关属以上分类单元的分类鉴定资料进行少量的修改补充后汇集成一册，仍用原来书名出版，故称之为伯杰氏鉴定细菌学手册第九版。2001年出版了伯杰氏系统细菌学手册第二版，分五卷出版，分别是古生菌门卷、变形菌门卷、厚壁菌门卷、拟杆菌门卷、放线菌门卷。芽胞杆菌分子分类研究进展。Ash等（1991）首次利用16S rRNA将51株芽胞

19、杆菌分为5大类群，许多种芽胞杆菌逐渐从芽胞杆菌属分化出来，另建属。在伯杰氏系统细菌学手册第一版中，将好氧和兼性厌氧的产芽胞细菌都列入了芽胞杆菌属。刘波（2006）出版著作芽胞杆菌文献研究中，采用老的分类体系芽胞杆菌近缘属全部归为芽胞杆菌属，列出了芽胞杆菌属244个种。伯杰氏系统细菌学手册第二版则完全按照16S rRNA原核生物的归群和分类（陶天申等，2007），列述了芽胞杆菌目22个属的212种芽胞杆菌（这些种中不包括同物异名）（George et al.，2004）。至今为止，芽胞杆菌从一个属分化演变出芽胞杆菌48个近缘属（Euzby，2011）。芽胞杆菌化学分类研究进展。化学分类方法的产生

20、和发展是细菌分类和鉴定技术的一大进步，用于化学分类的化学物质很多种，如极性脂（Coorevits et al.，2011）、呼吸醌（Zhai et al.，2011）、脂肪酸（Marquez et al.，2011）等。Abel et al.早在1963年就指出脂肪酸可用于细菌鉴定，Kmpfer（1994）证明脂肪酸生物标记具有遗传稳定性，可以作为芽胞杆菌属种类鉴定的有效手段。美国MIDI公司依据自20世纪60年代以来对微生物细胞脂肪酸的研究经验，开发的一套Sherlock 微生物鉴定系统分析软件（Sherlock Microbial Identification System MIS），根据

21、微生物中特定短链脂肪酸（C9-C20）的种类和含量进行微生物的鉴定，该软件可以操控Agilent公司的6850和6890型气相色谱，通过对气相色谱获得的短链脂肪酸的种类和含量的图谱进行比对，从而快速准确地对微生物种类进行鉴定。但是，该系统中芽胞杆菌属的种类仅有50多种，与目前芽胞杆菌属179个模式种的数量差距甚远。不过，Sherlock MIS系统自带的LGS模块，通过测定芽胞杆菌属模式种菌株脂肪酸，建立数据库，可以扩展该系统作为芽胞杆菌属种类鉴定的专业应用系统。刘波（2011）出版的微生物脂肪酸生态学中，以芽胞杆菌为例子，比较了脂肪酸鉴定与16S rRNA分子鉴定，结果表明，98%的芽胞杆菌

22、种类用脂肪酸鉴定结果与16S rRNA分子鉴定结果相同，脂肪酸芽胞杆菌种类鉴定可以作为芽胞杆菌快速鉴定的方法之一（刘波，2011）。特别在16S rRNA分子鉴定无法区别时，脂肪酸鉴定表现出其独特的优越性（Li et al.，2010）。虽然芽胞杆菌脂肪酸种类鉴定有较高的准确性，但是，利用脂肪酸进行芽胞杆菌种类的系统发育研究，分群结果与16S rRNA系统发育结果比较存在着异质性，表明脂肪酸分群存在着特殊的生物学意义（Connor et al.，2010；刘波，2011）。Sikorski et al.（2008）研究Bacillus simplex在以色列“进化谷”中的系统发育关系，模拟了进

23、化谷的生态环境，分析结果证明微生物系统发育包含多种脂肪酸成分、基因和细胞膜变化。张晓霞等（2009）利用脂肪酸成分对不动杆菌进行鉴定，研究结果表明脂肪酸鉴定结果和16S rRNA基因分析结果一致，在种水平上利用16S rRNA基因系统发育分析结果与脂肪酸组分分析的结果可互为补充，相互印证。Ehrhardt et al.（2010）利用脂肪酸成分可以区分不同培养上的蜡状芽胞杆菌的芽胞，脂肪酸成分是一种有效研究芽胞杆菌营养条件系统发育的手段。Haubert et al.（2011）研究喂食不同食物下Collembola heteromuru脂肪酸的变化，发现脂肪酸是可以作为不同食物来源的菌株有效标

24、记。邝玉斌等（2000）通过气相色谱对10种芽胞杆菌模式菌株的细胞脂肪酸组分及其含量进行分析，研究表明脂肪酸组分成为芽胞杆菌化学分类的重要指征。Diogo et al.（1999）研究发现利用脂肪酸利用区分Legionella 属大部分种类，利用脂肪酸成分建立准确的该属细菌自动鉴定系统。Whittaker et al.（2007）研究证明脂肪酸分析可以快速灵敏的鉴定Francisella tularensis。芽胞杆菌多相分类研究进展。Colwell（1970）提出多相分类（polyphasic taxonomy）的概念，即利用微生物的多种信息（传统分类、数值分类、分子分类、化学分类等），包括

25、表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统发育途径，目前已被广泛应用（Venkateswaran et al.，1999）。Yoon et al.（2004）综合利用形态、脂肪酸及16S rRNA系统发育分析将Bacillus halodebitrificans重新划分为Virgibacillus属。多相分类是传统的表型分类、数值分类和分子分类等方法的综合应用，因而可以更客观地反映生物间的系统发育关系（Dickinson et al.，2004）。最近的新种大都是根据多相分类法进行鉴定的。由于芽胞杆菌遗传背景的多样性和复杂性，至今为止，尽管采用多相分类研究方法，芽胞杆菌属的分类

26、地位仍然处于变化之中。芽胞杆菌系统发育研究进展。芽胞杆菌传统分类主要依据形态学特征，如菌落的培养特征、细胞形状等对未知菌进行分类鉴定。Gorden et al.（1973）提出芽胞形态群体概念，将芽胞杆菌分为三个类群；数值分类学是20世纪50年代后期随着电子计算机技术的兴起而逐渐发展起来的（Maugeri et al.，2001）；数值分类学通常也称为统计分类学（Taxomatrics）（Soumare et al.，1973；Cinto et al.，1984），伯杰氏鉴定细菌学手册第九版将数值分类学列为细菌分类学方法之首。Priest等（1988）对368株芽胞杆菌进行数值分类，将这些菌株

27、按SM（Simple Matching）距离值进行了系统发育分群研究。随着分子生物学的发展，芽胞杆菌的分类逐渐由表型分类转化为分子分类（Rooney et al.，2009），如G+C mol%、DNA-DNA杂交、PCR技术、16S rRNA序列比对、多位点序列分型（MLST）等等。DNA-DNA杂交通常被认为是微生物鉴定的标准（Turova et al.，1972；Stackebrandt et al.，1994）。借助于分子手段，许多新的物种也被发现出来（Coorevits et al.，2011）；Satomi et al.（2006）从宇宙飞船分离到一种芽胞杆菌，经16S rRNA序

28、列系统发育分析表明与Bacillus pumilus很相近但又有很多表型不同的地方，通过DNA-DNA、rep-PCR分析表明该菌株应是芽胞杆菌属的一个新种，并将此命名为Bacillus safensis。在进化分析时，我们通常要选择一个“进化时钟”，就是在选择序列分析时，要选取不同的物种的同源序列，这样结果才有可比性，这些被选取的序列就成为“进化时钟”。现在科学家们已经发现了各种各样的“进化时钟”，例如脂肪酸分析、同工酶分析、核糖体RNA分析、免疫分析等等。小亚基核糖体RNA以其独特优势被较广泛的作为进化时钟。小核糖体亚单位RNA 包括5S rRNA、16S rRNA和18S rRNA。核糖

29、体RNA具有以下优点：具有重要且恒定的生理功能；普遍存在于真核生物和原核生物中，而且在系统发育上具有适当的保守性；分子量大小适中，在细胞中含量大（约占细胞中RNA的90%）；高度保守，中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。不同物种的rRNA基因序列在某些位点会以不同的几率发生突变，它们在种属界等水平上表现出结构与功能的高度保守性，序列的相似性程度可以反映它们的系统发育关系。特别是16S rRNA由于分子大小适中（1.5 kb左右），既能体现不同种属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列而得到有关系统发育分析的充足信息。故被大多数生物学家所接受。16S

30、 rRNA的同源性分析最适合于属及属以上的远缘关系。芽胞杆菌全基因组系统分类研究进展。生物信息学是系统发育研究中重要的分析手段，它通过DNA序列间的差异计算出核苷酸多态性，并由此构建分子谱系树，推断群体的扩张模式、历史动态，推算群体起源、分歧的大致时间以及群体的进化速率、基因混合程度，甄别物种序列等，并可以给出统计学上的量化结果。它可以从分子水平上探讨群体进化的规律，并可将这些规律以直观、形象的方式表现出来。进化的实质，在一定程度上可以说是群居遗传构成上或基因频率上的变化和累积，通过计算等位基因频率等指标，可以了解其遗传进化关系。为了更好研究亲缘关系比较近微生物的系统发育关系，许多研究者逐步地采用多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）法进行分析（Tourasse et al.，2011）。众所周知，蜡状芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌无论是从形态还是通过DNA-DNA杂交都很难将其区分开来，利用多位点序列分型法解决了