异养硝化好氧反硝化菌协同竞争对脱氮特性的影响Word格式文档下载.docx

1、 1.2培养基 异养硝化培养基（g/L）：（NH4）2SO40.50g，柠檬酸三钠3.46g，维氏盐溶液50mL，C/N=8，加水溶解，补充蒸馏水至1L，pH=7.5. 好氧反硝化培养基（g/L）：KNO30.77g，柠檬酸三钠3.46g，维氏盐溶液50mL，C/N=8，加水溶解，补充蒸馏水至1L，pH=7.5. 维氏盐溶液（g/L）：K2HPO45.0g，MgSO47H2O2.5g，NaCl2.5g，MnSO44H2O0.05g，FeSO47H2O0.05g. LB培养基（g/L）：蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，牛肉膏3.0g，加水溶解，补充蒸馏水至1L，pH=7.5，用于菌株活化.

2、 以上所有培养基均在0.11MPa、121下灭菌30min，冷却后备用. 1.3试验方法 1.3.1菌株的系统发育分析 菌株XH02、XH03和FX03基因组DNA的提取以及16SrDNA的PCR扩增和测序均由*生工生物工程技术服务公司完成.将其基因序列提交至GenBank开展Blast检索，然后用MEGA6.0软件，以Neighbor-Joining法构建系统发育图. 1.3.2异养硝化和好氧反硝化特性的测定试验 种子培养液：挑取XH02、XH03和FX03单菌落分别接种于装有100mLLB培养基的250mL锥形瓶中，30、150r/min下摇床振荡培养8h，取出10mL菌悬液以4000r/

3、min离心5min，弃去上清液，取5mL无菌水将细菌混匀洗涤一遍，再离心，弃去上清液，取2mL无菌水，将留在离心管底部菌体悬浮混匀后全部转移到装有50mL无菌水的100mL锥形瓶中，混匀，作为菌株的种子培养液. 菌株组合方案：在无菌条件下分别取各菌株的种子培养液，按表1所示方案中对应的接种量分别接种于异养硝化和好氧反硝化培养基中，于30、150r/min下培养72h，每隔12h检测培养液中菌体生长量（A600）、（TN）、（NH4+-N）、（NH2OH）、（NO3-N）和（NO2-N）的变化，测定（NH4+-N）、（NO3-N）、（NO2-N）和（NH2OH）时，均用经离心后细菌培养液的上清液

4、，测定（TN）时则用细菌悬浊液. 2.2单菌株的脱氮特性 2.2.1单菌株的异养硝化特性 菌株XH02的异养硝化过程见图2（a）.由图2（a）可见，XH02菌在24h内的生长速率最快，A600在第36小时到达最大值（1.27），之后长时间处于稳定期，随着菌体的增殖过程，反应体系中（NH4+-N）和（TN）从反应前的101.68和104.83mg/L降至9.96和20.71mg/L，NH4+-N和TN的去除率分别为90.2%和80.2%. 异养硝化过程中NH2OH一直存在，呈现出先升后降的趋势，第24小时到达最大值（41.06mg/L），随着反应开展又逐渐降解，在第72小时NH2OH基本完全降解

5、.反应体系中不产生NO3-N和NO2-N.菌株XH03的异养硝化过程见图2（b）.由图2（b）可见，在24h内，菌体大量生长繁殖，之后逐渐生长缓慢，在第36小时A600到达最大值（1.23）. 第24小时菌株对NH4+-N的去除率为89.5%，对TN的去除率为84.3%.异养硝化过程中，没有检测到NH2OH.菌株FX03的异养硝化过程见图2（c）.由图2（c）可见，第24小时NH4+-N和TN的去除率分别为90.6%和71.5%在第36小时A600到达最大值（1.19）. 反应过程中，检测到有NH2OH和NO3-N产生，（NH2OH）在第24小时到达最大值（23.73mg/L），（NO3-N）

6、在第36小时到达最大值（25.72mg/L），随着反应开展NH2OH和NO3-N在第72小时基本完全降解.2.2.2单菌株的好氧反硝化特性菌株XH02的好氧反硝化过程见图3（a）. 由图3（a）可见，XH02在1224h内生长较快，A600在第36小时到达最大值1.14.第24小时（NO3-N）和（TN）从反应前的101.07和102.27mg/L降至8.26和17.28mg/L，去除率分别为91.8%和83.1%.反应后期检测到有NH4+-N产生，（NH4+-N）最大值为1.02mg/L. 图2菌株的异养硝化过程 图3菌株的好氧反硝化过程 菌株XH03的好氧反硝化过程见图3（b），由图3（b

7、）可见，在第24小时NO3-N和TN的去除率分别为94.0%和90.2%，在2472h内（NO3-N）和（TN）基本保持不变.A600在第36小时到达最大值（1.20），在第72小时降至1.07. 由图3（c）可知，菌株FX03在第24小时对NO3-N和TN的去除率分别为63.7%和60.3%，在第36小时A600到达最大值（0.78）.反应体系中（NH4+-N）的变化范围为0.523.61mg/L. 菌株XH02、XH03和FX03的好氧反硝化过程中，（NO2-N）分别低于4.37、2.32和1.62mg/L，与各自空白样对照，均无显著性差异（P0.05）. 2.3复合菌株的脱氮特性 2.3

8、.1复合菌株的异养硝化特性 复合菌株XH02+XH03、XH02+FX03、XH03+FX03和XH02+XH03+FX03的异养硝化过程见图4.由图4（a）可见，复合菌株XH02+XH03在第24小时对NH4+-N和TN的去除率分别为97.1%和87.6%，在第36小时A600到达最大值（1.34）.反应过程中（NH2OH）在第36小时到达最大值，无NO3-N和NO2-N的产生. 复合菌株XH02+FX03的异养硝化过程见图4（b），由图4（b）可见，NH4+-N和TN的去除率在第24小时到达81.5%和66.3%，在第36小时A600到达最大值（1.04）.反应过程中（NH2OH）和（NO

9、3-N）在第36小时都到达最大值，分别为22.34和15.29mg/L，在第72小时NH2OH和NO3-N基本完全降解. 由图4（c）可见，复合菌株XH03+FX03在24h内快速生长，A600在第36小时到达最大值（0.90），在第24小时对NH4+-N和TN的去除率为75.7%和54.9%.反应过程中（NH2OH）在第24小时到达最大值（12.27mg/L），（NO3-N）在第36小时到达最大值（15.29mg/L）.复合菌株XH02+XH03+FX03的异养硝化过程见图4（d）. 由图4（d）可见，在第24小时对NH4+-N和TN的去除率分别为84.9%和72.7%，在第36小时A600

10、到达最大值（1.18）.反应过程中（NH2OH）和（NO3-N）在第36小时到达最大，在第72小时基本完全降解. 2.3.2复合菌株的好氧反硝化特性 复合菌株XH02+XH03的好氧反硝化过程见图5（a）.由图5（a）可见，24h内菌体生长快速，A600在第36小时到达最大值（1.28）.（NO3-N）和（TN）在第24小时从反应前的101.07和102.27mg/L降至4.26和9.27mg/L，去除率分别为96.7%和90.6%.反应过程中（NH4+-N）低于0.88mg/L. 由图5（b）可知，复合菌株XH02+FX03对NO3-N和TN去除率在第24小时分别为54.7%和45.1%.第

11、36小时A600到达最大值（0.92）.反应过程中，（NH4+-N）的变化范围为0.640.88mg/L.复合菌株XH03+FX03的好氧反硝化过程见图5（c）.由图5（c）可见，在第24小时对NO3-N和TN的去除率为52.3%和42.1%.A600在第36小时到达最大值（0.85）.反应过程中（NH4+-N）低于1.89mg/L. 由图5（d）可见，复合菌株XH02+XH03+FX03在第36小时的A600到达最大值（1.02），在第24小时NO3-N和TN的去除率为75.5%和65.3%.反应过程中（NH4+-N）较低.复合菌株XH02+XH03、XH02+FX03、XH03+FX03和

12、XH02+XH03+FX03在好氧反硝化过程中（NO2-N）分别低于1.87、1.87、2.04和3.17mg/L，与各自的空白样对照，均无显著性差异（P 2.4菌株间脱氮特性的比照 2.4.1菌株间异养硝化特性的比照 以NH4+-N为底物时，单菌株和所有复合菌株在第24小时对NH4+-N和TN的去除率均到达最大值，在第36小时A600到达最大值，因此，选择第24小时对NH4+-N和TN的去除率及第36小时的A600比较菌株间的异养硝化特性.由图6可见，菌株XH02、XH03和FX03对NH4+-N的去除率无显著性差异（P 复合菌株XH02+XH03、XH02+FX03、XH03+FX03和X

13、H02+XH03+FX03对NH4+-N的去除率均有显著性差异（P0.05）.复合菌株XH02+XH03+FX03对TN的去除率高于XH02+FX03和XH03+FX03.菌株XH02和XH03的A600无显著性差异（P0.05），FX03与XH02、XH03有显著性差异. 3讨论 3.1单菌株的脱氮过程以及高效脱氮特性 Ridson等研究说明，NH4+-N可以通过两种途径转化为气态氮：NH4+-NNH2OHNO2-NNO-3-N，然后再复原为气态氮;NH4+-NNH2OHNON2ON2，直接产生气态氮，通过生物脱氮作用不会产生NO3-N和NO2-N. 菌株XH02的硝化过程产生NH2OH，不

14、产生NO3-N，并且NH4+-N和TN大大降低，因此，菌株XH02去除NH4+-N应由途径完成，这与菌株Y-10和WXZ-4的脱氮途径一样.菌株XH03在硝化过程中对NH4+-N和TN的去除率较高，无NO3-N的产生，它的脱氮应由途径完成. 菌株FX03的硝化过程中，有NO3-N的产生，其脱氮应由途径完成的.菌株XH02、XH03和FX03在异养硝化和好氧反硝化的过程中都不产生NO2-N，这与好氧反硝化菌DL-23脱氮过程积累大量NO2-N不同.由于NO2-N具有致癌性，所以菌株脱氮过程中不产生NO2-N对生物脱氮具有重要意义. 3个菌株在好氧反硝化过程后期都检测到少量NH4+-N的产生，这与

15、HE等的研究中反硝化过程产生少量NH4+-N的结果相一致.当碳源为柠檬酸三钠、氮源为（NH4）2SO4或KNO3并且其初始质量浓度为100mg/L左右时，菌株XH02在第24小时对NH4+-N和NO3-N的去除率均到达90%以上. 李紫惠等研究发现，在氮源初始质量浓度为250mg/L左右时，菌株XH02对NH4+-N和NO3-N的去除率在第24小时只能到达80%左右，因此，氮的初始浓度会影响脱氮效率.菌株XH03和FX03都属于假单胞菌属，XH03有着较好的异养硝化和好氧反硝化能力，在第24小时对NH4+-N和NO3-N的去除率分别到达89.5%和94.0%，与假单胞菌株y3相似. 菌株FX0

16、3对NH4+-N的去除率远大于对NO3-N的去除率，这一特点类似于不动杆菌TN14，显著不同于菌株C3，C3可以反硝化去除NO3-N但却不能开展异养硝化去除NH4+-N. 3.2菌株间的协同与竞争对异养硝化特性的影响 微生物间存在着多种复杂的相互关系，如互生、共生、拮抗等.根据有效微生物技术原理，不同的脱氮菌共存于同一环境时，如果相互之间生态位分离，形成了互生关系，就能产生协同作用，相互提供营养及其他生活条件，相互受益，促进彼此的生长繁殖. 因此异养硝化-好氧反硝化菌共同培养存在的协同和竞争作用会影响脱氮性能，同样地，通过对单菌株和复合菌株脱氮性能的研究可以揭露菌株之间的协同竞争作用.复合菌株

17、XH02+XH03的A600较相应的单菌株提高了10%左右（见图6），说明在同一个异养硝化反应体系中菌株XH02和XH03具有协同作用，能够相互促进生长.复合菌株XH02+XH03对NH4+-N和TN的去除率较两单菌株XH02和XH03都有提高. 菌株XH02和XH03通过协同作用进一步提高了脱氮效率.尹明锐等研究发现，异养硝化-好氧反硝化菌WYLW1和WYLW4组合的复合菌株F1较单菌株也能提高NH4+-N的去除率，因此，在异养硝化过程中菌株之间的协同作用对提高脱氮效率具有重要意义. 复合菌株XH02+FX03、XH03+FX03的A600较其相应的单菌株都有下降，因此，在同一个异养硝化反应

18、体系中菌株XH02和FX03、XH03和FX03相互竞争，抑制了生长，这种竞争作用导致复合菌株XH02+FX03、XH03+FX03对NH4+-N和TN的去除率显著下降. 比较复合菌株XH02+XH03+FX03与XH02+XH03对NH4+-N和TN的去除率以及A600可发现，菌株FX03的存在抑制了菌株XH02和XH03的生长，降低了脱氮效率，进一步证明了菌株FX03对菌株XH02和XH03的竞争作用.这与复合菌株N2+N4+N7间的竞争作用类似，比相应单菌株的异养硝化效率差. 可见脱氮效率高的单菌株组合并不一定能取得好的脱氮效果，菌株之间的竞争作用会降低脱氮效率.在异养硝化条件下，比较复

19、合菌株对NH4+-N和TN的去除率以及A600可以发现，在等量菌株XH02、XH03和FX03共存的异养硝化过程中，菌株XH02和XH03间的协同作用强于FX03对XH02和XH03的抑制作用. 3.3菌株间的协同与竞争对好氧反硝化特性的影响 复合菌株XH02+XH03的A600较两单菌株提高了10%左右（见图7），而对NO3-N和TN的去除率较单菌株只有小幅的提高，说明菌株XH02和XH03在好氧反硝化的反应体系内相互促进了生长，但对脱氮效率的影响小.呼婷婷采用吸附复合的方式组合了异养硝化-好氧反硝化菌Y1和L1，结果说明，复合菌株对NO3-N的去除率较单菌株有较大提高，因此，不同的复合方式

20、会影响菌株之间的协同和竞争作用. 在好氧反硝化过程中菌株FX03对XH02、XH03表现出竞争作用，抑制了XH02和XH03的生长，使复合菌株对NO3-N和TN的去除率下降.在等量菌株XH02、XH03和FX03共存的反应过程中，菌株XH02和XH03的协同作用强于FX03对XH02和XH03的抑制作用. 不同异养硝化-好氧反硝化菌之间既有协同又有竞争，在脱氮过程中，通过提高异养硝化-好氧反硝化菌之间的协同作用、降低竞争作用，能够促进脱氮效率进一步提高，可为新型脱氮工艺的研究提供参考. 4结论 a）菌株XH02和XH03对NH4+-N和NO3-N的去除率较高，当氮源初始质量浓度为100mg/L

21、左右时，第24小时对NH4+-N的去除率分别到达90.2%和89.5%，对NO3-N的去除率分别到达91.8%和94.0%.菌株FX03对NH4+-N的去除率远高于对NO3-N的去除率. b）复合菌株XH02+XH03在异养硝化和好氧反硝化脱氮过程中能够相互协同、促进生长、提高对氮的去除率.c）在异养硝化和好氧反硝化的过程中，菌株FX03的存在会抑制菌株XH02和XH03的生长，降低脱氮效率.d）在等量菌株XH02、XH03和FX03共存的异养硝化和好氧反硝化过程中，菌株XH02和XH03之间的协同作用强于菌株FX03对XH02、XH03的竞争作用. 来源：环境科学研究； 黄郑郑，曹刚，陈海升，李紫惠，莫测辉