数字PCR可行性分析Word下载.docx

1、法预测其是否有先天性疾病，是预防染色体病患儿出生的主要措施。传统的产前诊断采用侵入性诊断（invasiveprenataldiagnosis）方法，主要包括孕中期的胎儿羊水的产前诊断、脐血的产前诊断，目前常用的取材手术主要有绒毛膜绒毛取样，羊膜腔穿刺，脐带血穿刺等，但这些方法对母体和胎儿均有一定的创伤并存在胎儿丢失风险。而非侵入性产前诊断（non-invasivediagnosis,NIPD）则采用了无创伤的技术方法避免了以上的安全威胁，成为当下引起广泛关注的诊断方法。1997年，Lo等采集孕妇血液进行研究，利用PCR的方法扩增Y染色体特异片段并出现阳性信号，证明母体血液中存在胎儿的DNA10

2、，自此拉开了NIPD研究的序幕。但是，从大量母体DNA中成功检测到胎儿游离DNA的过程中存在相当大的难度，需要提高检测方法的灵敏度和特异性。2007年，Lo等利用数字PCR技术发展了两种策略用于产前诊断胎儿21三体综合症，其一称之为digitalRNA-SNP，检测胎盘细胞特异表达即完全来自胎儿的21号染色体上PLAC4mRNA的SNP位点的比例；其二为digitalRCD法，检测孕妇血液中21号染色体与1号染色体的相对含量，可以检测到血液中25%的胎儿基因11。Lun等12比较了数字PCR与实时定量PCR、质谱检测三者的灵敏度，发现数字PCR比其他两种方法更为精确，因此，数字PCR检测到胎儿

3、基因的浓度可能要高于预期。随着研究的深入，数字PCR被证明比传统技术方法具有更高的临床灵敏度和特异性，未来该技术在产前诊断领域将越来越被广泛地应用。1.稀有突变分析在基因组变异研究领域，群体基因组水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）检测面临的问题主要是突变序列往往与大量正常序列同时存在，竞争性反应严重影响突变序列的检测精度，数字PCR技术带来的极高的扩增特异性在稀有突变检测方面具有天然的优势，在癌症标志物检测、无创产前检查、线粒体突变检测等研究方向上，我们已经看到dPCR的许多精彩表现。稀有突变检测对癌症研究具有重大意义。原癌基因或肿瘤

4、抑癌基因的突变累积是促进肿瘤发生的一个重要因素。极少量体细胞的上述突变即足以促进癌症发生或发展。由于上述突变通常只存在于极少量的细胞中，因此需要使用具有高信噪比和低假阳性率的Assay。常用的SNP基因分型技术（如毛细管电泳或实时荧光定量PCR）是最高效的突变检测方法，可以检测突变率不低于20% （约五分之一细胞）的突变细胞。但是，数字PCR能够从野生型背景中鉴别出突变基因，具有更高的灵敏度和精度。数字PCR通过将样本分到芯片的数千个单独的PCR反应中，大大降低了某个反应中的总分子数，从而有效地富集目标序列，并稀释了野生型背景。2.拷贝数变异（CNV）鉴定拷贝数变异 （CNV） 是基因座的野生

5、型拷贝数相比参考基因组增加或减少造成的基因组失衡。这些基因组改变从小的 （小于 10 kb） 插入或缺失到大的（超过1 Mb）、复杂的多等位基因复制均有。CNV 是人类基因组中最常见的遗传变异，与多种疾病有关，包括癌症或遗传性疾病易感性 13, 14。因此，我们需要简单可靠的方法定量CNV，用作潜在的生物标记物，并用于了解肿瘤形成的分子机制。目前的 CNV 评估方法如表1所示。这些方法包括原位杂交，但该方法耗时、费力且结果分析具有主观性15。阵列比较基因组杂交 （aCGH） 可以提供更高的精度，但该方法需要大量的操作时间且分辨率取决于所需的阵列类型 16。最近，下一代测序技术的进步使得通过单次

6、运行即可经济高效地检测多种类型的遗传变异成为可能17。最后，在目前所有方法中，实时荧光定量和数字 PCR 技术提供了最简单的工作流程，可以获得准确的拷贝数结果，且操作时间极短，周转时间较快。 HER2 （人表皮生长因子2，又称为ERBB2） 是一种原癌基因，在特定的情况下会促进癌症细胞的增殖。原癌基因促进肿瘤发生的机制有三种：（1） 染色体重排导致超活性基因融合，（2） 编码序列上的点突变或缺失导致超活性蛋白生成，（3） 基因扩增导致蛋白质过表达。HER2基因扩增多年来一直被视作早期乳腺癌预后不佳的指标之一，亦是选择早期和晚期癌症最佳治疗方案的关键因素 （例如，使用赫赛汀Herceptin 进

7、行HER2蛋白靶向治疗） 目前，原位荧光杂交 （FISH） 和银染原位杂交（SISH） 是用于预后情况和药物有效性评估的常规方法。但是上述方法存在诸多缺点，包括冗长繁琐的染色和切片制备过程、需要专业的技术培训、检测成本较高。同时传统方法在某些具有挑战性的情况下进行结果判断时会引入一定程度的主观因素。皇家萨里郡医院致力于探索采用数字 PCR （dPCR） 作为SISH的替代方法用于HER2拷贝数检测，以改善技术和成本。数字 PCR 将样本模板分散到众多单独的 PCR 反应器中，其中一部分反应器含有目标分子 （已扩增），另一部分则不含有目标分子 （未扩增，称为阴性）。PCR 扩增后，利用阴性反应部

8、分计算样本中目标分子的绝对数量，无需参照标准品，可实现对目标 DNA 分子的绝对定量。因此，相比目前用于评估 HER2 基因扩增的SISH 方法，该技术能够降低主观性，提升标准化水平，而且可节省超过75%的成本。3.MicroRNA前体定量越来越多的证据表明，microRNA是参与几乎所有生物学过程的基本元件。成熟microRNA可介导microRNA依赖性的基因沉默。尽管microRNA前体是microRNA生物发生和加工的基础，但现有的大多数检测方法仍致力于成熟microRNA的检测，针对microRNA前体的检测却很少。microRNA前体检测面临的挑战主要归因于其较低的丰度、必须使用参

9、照转录本，以及序列相似性造成的干扰。Life Technologies开发的基于硅芯片的QuantStudio 3D数字PCR系统可以大大提升mir-9初级前体转录本检测的精确度。检测原代神经细胞培养物中同一microRNA的3个不同的前体-miR-9 （pri-miR-9-1、-2和-3），结果显示，采用QuantStudio 3D数字PCR系统可以轻松克服传统microRNA前体检测方法面临的挑战。研究证明短期和长期酒精暴露，可以触发培养细胞中miR-9前体的变化。检测可重复性极高，精度范围为1.26-2.33%。其中一种miR-9前体嵌于蛋白质编码的mRNA转录本内，而其他两种前体则是长

10、的非编码转录本，这些结果说明了数字PCR （dPCR）方法的通用性。数字PCR的市场前景数字PCR是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。迄今为止,已有Fluidigm、Bio-Rad等几家公司相继推出了数字PCR产品,这些产品已经在单细胞分析、癌症早期诊断和产前诊断等研究领域显示出巨大的技术优势和应用前景。根据全球知名咨询公司Frost & Sullivan的研究分析师Karolina Olszewska表示：“dPCR的高灵敏度让它成为多个应用的理想选择，包括拷贝数变异、稀有突变检测以及核酸序列的绝对定量。数字PCR因其精确性、重复性以及在诊断和制药应用上的潜力而引起了行业的极大关注。在这

11、一高速增长、前景广阔的市场，Bio-Rad在数字PCR上的投资是富有成效的。”据Frost &Sullivan预计，2011-2016年间数字PCR仪器市场将以52%的年均复合增长率增长。Frost & Sullivan发布的美国qPCR和dPCR仪器市场的分析报告指出，美国的实时定量PCR和数字PCR仪器市场正处在不同的增长阶段，但两者都保持竞争活力。尽管qPCR市场很成熟，但其竞争力正在扩张，因为几个大牌的生命科学公司进入此市场，希望扩展它们的基因组学流程方案。同时，新兴的dPCR市场也在快速增长，早期采用者增加，而供应商也在扩展技术应用，以拓宽应用范围。dPCR作为一项新技术，仪器定价仍

12、然较高，让很多实验室望而却步。dPCR目前的客户仅限于制药和生物技术公司，以及一些资金充裕的大型科研实验室。据DeciBio预计, 2016年生命科学仪器市场预计$458亿,中国是最强驱动力。一个高增长的技术领域是数字PCR，该技术的复合增长率将飙升至90%，从2011年1000万美元升至2016年2.5亿美元。数字PCR的操作步骤2013年下半年，Life-technologies推出的QuantStudio 3D数字PCR系统采用最简单的工作流程，只需极少的手工操作步骤和极短的操作时间。该系统的核心是一块包括20000个反应孔的硅芯片，每块芯片运行一个样本，在一次实验中可同时分析两个靶点。

13、每个QuantStudio 3D芯片试剂盒包括12块芯片及盖子、12个上样刮板和3个浸液注射器及针头。PCR预混液的制备与实时荧光定量PCR反应相同，将TaqMan Assay、DNA或cDNA样本以及预混液加入一支试管内混匀（步骤1）。此外，QuantStudio 3D芯片是独立包装的一次性耗材，可最大程度降低样本受到污染的危险。上样刮片也是一次性使用，简化了芯片上样过程。制备好反应混合物后，使用自动芯片加载系统上样，打开加载系统，将打开的芯片放置于上样底座上（步骤2）；将上样刮片置于加载系统臂的固定装置上（步骤3）；将芯片盖子放置于仪器转臂的固定装置上（步骤4）；将反应混合物加至上样刮片（

14、步骤5）；按下按钮，分配器自动将反应混合物分配至芯片的20000个反应孔内（步骤6），然后密封芯片（步骤7）（芯片密封剂可以在紫外光下发生固化，密封剂经自动上样设备上的紫外装置激活，对芯片进行密封）；密封后可以在带有双平板模块的热循环仪上对芯片进行扩增，在热循环仪上进行扩增需要约2个半小时（步骤8）；QuantStudio3D 数字PCR系统一次读取一块芯片（步骤9），需要30秒完成读数（在芯片读取过程中，仪器读取芯片唯一的标识符，捕获扩增样本的荧光信号，芯片读数中会捕获所有反应孔的ROX、FAM和VIC通道荧光图像，数据输出为FAM和VIC通道的计数（拷贝数/微升）；通过ROX信号确认反应孔

15、中是否存在样本）；最后，将数据写至用户定义的目标位置仪器、USB驱动器、联网服务器等，使用QuantStudio3D AnalysisSuiteTM现有的软件模块，可以对实验结果进行进一步的数据和图像分析。步骤1步骤2步骤3步骤4步骤5步骤6步骤7-1 步骤7-2步骤8-1步骤8-2步骤8-3步骤9Fluidigm公司2006年底推出的Bio-Mark基因分析系统由Bio-Mark实时PCR系统（整合了高性能计算机）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（将生物样品、反应试剂导入到IFC微液流芯片中）和数据分析软件四部分构成。IFC微液流芯片有2种：Dynamic Array

16、（48.48动态芯片和96.96动态芯片）和Digital Array（12.765数字芯片和48.770数字芯片）。数字芯片将预混液（样品与PCR试剂）分成数百个单独的PCR反应，开展数字PCR分析。整个过程分为五步：准备芯片；将每个样品预混液移液至芯片的独立入口；将芯片放入IFC Controller，利用软件界面迫使分析组分进入单独的反应板；将芯片放入BioMark系统，开展热循环和荧光检测；利用分析软件来查看和分析扩增曲线。与上面两者相比，浙大的SPC芯片系统（图2）采用自吸式分液进样芯片，进样方法简便，无需外源动力。ZJU 自吸式分液进样芯片既是耗材又有自动分配反应液的功能。相当于简

17、化了QuantStudio 3D数字PCR系统的步骤2-步骤7，也无需像Fluidigm公司一样利用IFC Controller仪器进样。图2 ZJU 自吸式分液进样芯片成本分析数字PCR的流程比传统的qPCR更简单，但通量较低，基本每块芯片上千个反应单元都是针对单一样本的分析，而荧光检测技术的局限性限制了多个芯片的同时检测。结论生物学的基础研究和分子技术的前进伴随着更精确和更灵敏的测量技术发展。dPCR具有测量独立性与无需任何校准物的特点。因此，该技术是潜在的核酸测量基准方法，并从原理上为核酸计量提供了保证19。相比其他方法，dPCR作为绝对定量方法能准确定量目标DNA和提供可靠的定量数据4

18、。商业化dPCR仪器（如Fluidigm公司的BioMarkSystem）的大量出现进一步推动和扩大了该技术的发展和应用范围。参考文献：1.M Baker.（2012）. Digital PCR hits its stride. Nature methods,9（6 ）: 541-544.2.Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. （1992）.Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques, 13（3）: 44

19、4-449.3.Vogelstein, B. & Kinzler, K.W. （1999）. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 96（16）:9236-9241.4.Kalinina, O; Brown J, Silver J （1997）.Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Research, 25 （10）: 1999-2004.5.V Marx.（2014）. PCR: paths to sensitivity. Nature methods ,11（3）:24

20、1-245.6.YungTK,ChanKA,MokTS,TongJ,ToK-F,LoYD.（2009）.Single-moleculedetectionofepidermalgrowthfactorreceptormutationsinplasmabymicrofluidicsdigitalPCRnonsmallcelllungcancerpatients.ClinicalCancerResearch,15（6）:2076-2084.7.WangRamakrishnanR,TangZ,FanW,KlugeA,DowlatiJonesRC,MaPC.（2010）.QuantifyingEGFRa

21、lterationsthegenomewithnanofluidicarrays.chemistry,56（4）:623-632.8.TalyV,PekinD,BenhaimL,KotsopoulosSK,LeCorreLiX,AtochinI,LinkDR,GriffithsAD,PallierK.（2013）.MultiplexpicodroplettodetectKRAScirculatingDNAfromcolorectal59（12）:1722-1731.9.QiY,DengWuH,ZhouG,KajiyamaT,KambaraH.（2011）.Digitalanalysisexpr

22、essionlevelsmultiplecancer-relatedgenesmultiplexeddigital-PCRcoupledhydrogelbead-array.Analyst,136（11）:2252-2259.10.LoCorbettaN,ChamberlainPF,RaiSargentIL,RedmanCW,WainscoatJS.（1997）.Presencefetalmaternalandserum.TheLancet,350（9076）:485-487.11.LoYM,LunFM,KC,TsuiNB,ChongLauLeungTY,ZeeBC,CantorCR,ChiuRW.（2007）.Digitalformolecularchromosomalaneuploidy.ProcNatlAcadSciUS104（32）:13116-13121.12.LunRW,AllenYeungKinDennisYM.（2008）.Microfluidic