在食源性肥胖中三七总皂苷通过瘦素介导 STAT3信号通路调节肠道微生物群促进生热米色脂肪细胞重建.docx

1、在食源性肥胖中三七总皂苷通过瘦素介导 STAT3信号通路调节肠道微生物群促进生热米色脂肪细胞重建Theranostics治疗学IF=8.5792020; 10(24): 11302-11323. doi: 10.7150/thno.47746在食源性肥胖中三七总皂苷通过瘦素介导的AMPK/ STAT3信号通路调节肠道微生物群，促进生热作用和米色脂肪细胞重建摘要：背景：在白色和棕色脂肪细胞中激活产热程序为增加肥胖症治疗期间的能量消耗提供了有希望的途径。促进棕色脂肪细胞生热或白色脂肪细胞褐变的内源机制表明，肠道微生物是宿主能量平衡的关键调节剂。 然而，尚不清楚治疗干预诱导的肠道菌群调节对脂肪细胞褐

2、变的影响是否还涉及瘦素的调节。方法：通过身体成分分析，红外热像仪观察，透射电镜和HE染色分析脂肪特征。 通过qRT-PCR，免疫印迹，免疫组织化学和免疫荧光染色检测脂肪组织中的基因和蛋白质表达。 通过16S rRNA基因扩增子测序鉴定肠道微生物组特征，并对高脂饮食诱导的肥胖症（DIO）小鼠和抗生素诱导的微生物组消耗小鼠进行粪便微生物群移植。结果：三七总皂甙（PNS）处理可通过增加黏液Akkermansia muciniphila嗜粘蛋白-艾克曼菌和Disparasonoides Distasonis狄氏副拟杆菌的丰度来塑造鼠类肠道微生物组，结果，DIO小鼠具有远端肠道菌群，具有明显降低宿主脂肪

3、的能力。 PNS诱导的DIO小鼠肠道菌群的调节可通过激活瘦素-AMPK / STAT3信号通路来增加棕色脂肪组织（BAT）的生热和米色脂肪细胞的重建，从而促进能量消耗。瘦素对PNS的抗肥胖作用具有重要影响。在瘦素缺乏的情况下，PNS诱导的肠道微生物群的调节会对白色脂肪组织（WAT）的生热和褐变产生负面影响，这表明PNS无法减轻瘦素基因缺陷小鼠的肥胖。 PNS诱导的肠道菌群调节对抗生素诱导的微生物组耗竭的DIO小鼠影响最小，这证实了肠道菌群改变与DIO小鼠脂肪组织重塑之间的相关性。瘦素对C3H101 / 2细胞中AMPK/ STAT3信号通路褐变的直接影响支持我们的体内结果，即PNS调节的肠道菌

4、群诱导的瘦素-AMPK / STAT3通路信号参与了米色脂肪细胞的重建。结论：我们的研究结果表明，瘦素信号传导对于改变微生物-脂肪串扰至关重要，并为肥胖症的治疗干预提供了有希望的途径关键词：肠道菌群，肥胖，白色脂肪细胞，米色细胞，瘦素引言肥胖是全球最普遍的流行病之一，是脂肪细胞过度积累的结果1，而脂肪堆积可能会导致卡路里摄入和能量消耗之间的不平衡。不同类型的脂肪细胞在调节能量稳态方面具有截然相反的功能。棕色脂肪组织（BAT）通过激活线粒体中的解偶联蛋白1（UCP-1）来耗散能量，并通过生热作用转化脂肪以抵抗肥胖。相比之下，白色脂肪组织（WAT）通过甘油三酸酯的合成和积累来负责能量存储2。附睾脂

5、肪细胞积累与肥胖和胰岛素抵抗的发展密切相关。相反，皮下脂肪细胞的膨胀与肥胖风险几乎没有甚至成反比3。 WAT中的其他热原性细胞被定义为米色或类似褐色的脂肪细胞4，它们表现出增加的生热能力，并且与棕色脂肪细胞具有相似的特征5，并且可以通过表达UCP-W从WAT中的其他细胞6转化1，过氧化物酶体增殖物激活受体-共激活物1-（PGC1-）和含PR结构域的16（PRDM-16）7。越来越多的数据表明，肠道微生物群是调节BAT中白至棕脂肪转化和无颤抖生热的重要内源性因素8。先前的研究表明，“冷”菌群的转移可以增加受体中米色脂肪细胞的重建率9，并可以连续改善胰岛素灵敏度和能耗。抗生素诱导的微生物组耗竭的小

6、鼠的WAT表现出褐变表型，微生物群耗竭促进嗜酸性粒细胞浸润，2型细胞因子激活和M2巨噬细胞极化，从而导致米色细胞重建10。间歇性禁食引起的肠道改变微生物群可以刺激DIO小鼠的米色细胞中单羧酸盐转运蛋白1的表达11，但对遗传（ob / ob）肥胖小鼠的生热有负面影响12。瘦素脂肪细胞的分泌蛋白，是能量摄入和消耗的调节介质，可通过其对下丘脑的作用来增加BAT生热13，并通过激活Janus激活的激酶2（JAK2）增强WAT的褐变。 /信号转导和转录激活子3（STAT3）途径14或诱导STAT3-PRDM 16复合物15。肠道菌群可以影响瘦素相关的途径，从而减轻与肥胖相关的代谢紊乱，而肠道菌群对瘦素表

7、达和体重的作用也可能受到饮食脂肪摄入的影响16。因此，研究人员将针对针对肠道菌群的营养因子对瘦素参与褐变的抗肥胖作用进行更详细的研究。从这个角度出发，我们假设饮食中草药治疗将能够通过调节肥胖小鼠中包括肠道菌群的不同物种的丰度来促进褐变，并且这些作用是通过瘦素信号传导介导的。初步研究表明，三七总皂苷（PNS）的商业草药产品包括人参皂苷Rb1，Rd，Re，Rf和Rg1和三七皂苷R1（图S1A），可以控制肥胖小鼠的体重17。 PNS通过改善胆固醇中胆汁酸的生物合成和增加肝脏脂肪酸-氧化作用来发挥降脂作用18，其抗氧化和抗炎作用也参与了其对糖尿病小鼠的降血糖作用19，20 。肠道微生物群因其代谢产物的

8、活化和药理活性而具有重要影响21，已对其进行了广泛研究22。 PNS的药物渗透性低23，导致肠道吸收到人体的能力较弱，因此能够与肠道菌群接触更长的时间23，24。因此，在肠道中残留时间较长的PNS可能会影响肠道微生物生态系统。在这项研究中，我们发现PNS可以通过BAT生热和米色脂肪细胞重建来减少肥胖，并且PNS通过激活DIO小鼠中的瘦素-AMPK / STAT3信号通路来调节肠道菌群以诱导米色脂肪细胞重建。这项研究提供了另一个新的例子，其中肠道菌群的变化导致瘦素活化，从而诱导WAT中的褐变重塑，并表明PNS可以潜在地用作肠道菌群的调节剂，通过瘦素活化诱导脂肪重塑，从而对抗肥胖和肥胖症。相关的代

9、谢紊乱。方法药品PNS的UPLC分析来自三七的PNS购自中国。使用超高效液相色谱（UHPLC）系统（DionexUltiMate3000，Thermo Fisher Scientific，Dreieich，Germany）来鉴定和确认皂苷的百分比，包括三七皂苷R1和人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1和PNS中的Rd。使用反相ACE Excel C18（100 mm2.1 mm）分析柱进行分离。进行UHPLC分析时，以0.5 ml / min的流速进样5 l PNS样品。用乙腈和水修饰的梯度条件用于样品分析。用20乙腈开始梯度洗脱10分钟，乙腈浓度在15分钟内从20增加到46，在15分钟内从46

10、增加到55，并在55保持55。检测波长为203nm。收集来自高脂饮食（HFD）+ PNS组的粪便，将其溶解在薄荷醇中，并使用上述规程进行UHPLC分析。 PNS主要包含三七皂苷R1和人参皂苷Rb1，Rd，Re，Rf和Rg1，其化学结构与三萜皂苷类似，如图S1A所示。我们确定PNS包含9.76三七皂苷R1、35.1Rg1和38.98Rb1 25。动物实验所有动物实验均获得香港大学教学和研究中使用活体动物委员会的批准。喂食了常规饮食的肥胖B6.Cg-Lep ob / J（ob / ob）和C57BLKS / J-Leprdb / J（db / db）雄性小鼠购自杰克逊实验室（Bar Harbor，

11、ME）。给四周大的雄性野生型C57BL / 6J小鼠喂食HFD（60脂肪，20蛋白质，20碳水化合物； Research Diets，D12492）以诱导并保持肥胖。在实验开始时，将这些小鼠喂饲HFD 2周。当观察到常规食物喂养的对照组和HFD喂养的组之间有明显的变化时，将PNS溶液（每天400或800 mg / kg）或赋形剂口服给予HFD喂养的小鼠7周。在6-9周龄时，db / db和ob / ob小鼠接受了7周的PNS溶液注射（每天800 mg / kg）。对照组喂养普通的饮食，肥胖组口服相同体积的双倍蒸馏水。每周评估这三组小鼠的体重和食物摄入量。在实验的最后一周，使用Minispec

12、LF90人体成分分析仪（布鲁克公司）检测了脂肪量。对于口服葡萄糖耐量测试（OGTT），在禁食6小时后对HFD小鼠口服葡萄糖（2 g / kg），以测量其葡萄糖耐量，并在首次注射后立即开始不同时间点的血糖水平使用血糖仪（Accu-Check Performa，Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）检测葡萄糖的量。计算葡萄糖水平随时间的曲线下面积（AUC），以评估小鼠的葡萄糖耐受能力。根据制造商的介绍，使用商业试剂盒收集血清以检测总胆固醇（TC），甘油三酸酯（TG）和胰岛素水平。收集粪便，肝脏和脂肪组织，并储存在-80C下。代谢率和温度测量按照制造商的说明，使用综

13、合实验室动物监测系统（CLAMS，哥伦布仪器公司）评估了小鼠的新陈代谢。 将由HFD诱导的12周大的肥胖小鼠放在单独的笼子中，使其适应监测系统24小时。 通过在接下来的24小时内连续测量其氧气消耗量（VO2），二氧化碳产生量（VCO2）和热量产生来评估其代谢率。 每30分钟监控一次X轴光束中断产生的自愿活动。 用红外热像仪记录BAT周围的皮肤温度，并使用FLIR Research软件包（FLIR Research IR Max 3.4； FLIR； West Malling）进行分析。组织学和免疫荧光将小鼠组织和米色细胞用PBS中4（wt./vol）的多聚甲醛固定，并用苏木精和曙红对石蜡包埋的

14、切片进行染色，以进行常规形态学观察。根据标准方案，使用以下抗体和稀释液进行免疫荧光染色：UCP-1（RD，小鼠，1：200），PRDM-16（Abcam，兔，1：200）和BODIPY 493/503（Thermo Fisher Scientific，1：1000）。首先将样品用0.3Triton X-100透化，用5山羊血清溶液封闭，并与一抗在含1BSA的PBST中于4C的潮湿箱中孵育过夜。然后洗涤样品，将其与与Alexa Fluor 488/405/561（1：1000稀释; Invitrogen，USA）偶联的适当二抗一起进行免疫荧光染色，并用4，6-diamidino-2-phenyl

15、-吲哚（ DAPI）用于细胞核染色。使用Carl Zeiss LSM 780系统以200倍放大倍率观察并捕获免疫荧光图像。RNA提取和定量实时PCR通过使用RNAiso Plus试剂（日本Takara）分离总RNA，并基于260nm / 280nm的吸光度比测量浓度。 随后，用第一链合成试剂盒（日本宝酒）将1 g总RNA反转录为互补DNA。 对于每个样品，使用SYBR Green试剂（日本Takara）和LC480平台（美国Roche）一式三份进行PCR。 将靶基因的表达水平相对于内部对照（-肌动蛋白）的表达水平进行标准化。 引物序列在补充表S1中列出。蛋白质提取和蛋白质印迹分析用放射免疫沉淀

16、测定法（RIPA）裂解缓冲液提取蛋白质，并在12000 rpm和4C下离心10分钟。 通过SDS-PAGE分离蛋白质裂解物，随后转移至PVDF膜并在室温下封闭2小时。 将聚偏二氟乙烯膜与表S2中列出的特定目标一级抗体孵育，然后与适当的二级抗体（1：1000）在室温下孵育2小时。 用增强的化学发光底物（GE Healthcare，德国）和Bio-Rad GelDoc成像系统目测检测印迹。 免疫印迹分析是使用ImageJ软件进行的，免疫印迹的原始扫描图包含在补充图S10中。DNA提取和16S rRNA基因扩增子测序根据制造商的说明，使用QIAamp DNA Stool Mini试剂盒（德国QIAGEN）提取粪便细菌DNA。使用7415纳米分光光度计检测DNA浓度，并测量260/280和260/230的