ELISA操作要点文档格式.docx

1、 加样 在 ELISA中一样有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，幸免加在孔壁上部 ，并注意不可溅出，不可产动气泡。加标本一样用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应改换吸嘴，以避免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此 测定（如间接法 ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微 型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液进程迅速完成。 保温 在 ELISA中一样有两次抗原抗体反映，即加标本和加酶结合物后

2、。抗原抗体反映的完成需要有必然的温度和时刻，这一保温进程称为温 育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA中似不适当。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并非是 都有均等的和固相抗结合的机遇，只有最切近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个慢慢平稳的进程，因此需经扩散才能达 到反映的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也一样如此。这确实是什么缘故ELISA反映老是需要一按时刻的温育。温育常采纳的温度有 43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中经常使用的保温温度，也是大多数抗原抗

3、体结合的适合温度。在成立ELI SA方式作反映动力学研究时，实验说明，两次抗原抗体反映一样在37经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反映，可提高反 应的温度，有些实验在43进行，但不宜采纳更高的温度。抗原抗体反映4更为完全，在放射免疫测定中多使反映在冰箱中留宿，以 形成最多的沉淀。但因所需时刻太长，在ELISA中一样不予采纳。保温的方式除有的 ELISA仪器附有特制的电热块外，一样均采纳水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平稳 。为幸免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，现在可让反映板漂浮在水面上。假设用保温箱，ELISA板应放在湿 盒内

4、，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规 定的温度，专门是在气温较低的时候更应如此。不管是水浴仍是湿盒温育，反映板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平稳。室温温 育的反映，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25，但具体操作时可依照说明书的要求操纵温育。室 温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时刻应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不 宜多于两块板同时测定。 洗涤 洗涤在 ELISA进程中虽不是一个反映步骤，但却也决定实在验的成败。ELSIA确实是靠洗

5、涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，和在反映进程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等 塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。能够说在ELISA操作中，洗涤是最要紧 的关键技术，应引发操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，进程如下：（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反映液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分 钟，间歇摇

6、动，浸泡时刻不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应完全，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸 上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时刻。微量滴定板多采纳浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤 剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而减弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团 和水分子的结合作用，使蛋白质答复到水溶液状态，从而离开固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一样是吐温 20，其浓度可在%之间，高于%时，

7、可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低实验的灵敏度。（2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水乃至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地转动淋洗 ，持续冲洗 2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式那么比如淋浴，其洗涤成效更为完全，且也简便、 快速。已有实验说明，流水冲洗式一样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤成效 更佳。 显色和比色 显色 显色是 ELISA中的最后一步温育反映，现在酶催化无色的底物生成有色的产物。反映的温度和时刻仍是阻碍显色的因素。在一按时刻

8、内，阴 性孔可维持无色，而阳性孔那么随时刻的延长而呈色增强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反映温度和时 间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时刻一样不需要严格操纵，有时可依照阳性对照孔和阴性对照孔的显色情形适当缩 短或延长反映时刻，及时判定。OPD底物显色一样在室外温或37反映20-30分钟后即再也不加深，再延长反映时刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自 行变色，显色反映应避光进行，显色反映终止时加入终止液终止反映。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。TMB受光照的阻碍不大，可在室温中置于操作台上，边反映观看结果。但为保证明验结果的稳固

9、性，宜在规定的适那时刻阅读结果。T MB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即慢慢减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二 烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂都可使反映终止。这种终止剂尚能使蓝色维持较长时刻（12-24小时）不褪，是目视判定的良好终 止剂。另外，各类酸性终止液那么会使蓝色转变成黄色，现在可用特定的波长（450nm）测读吸光值。 比色 比色前应先用干净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的实验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，如此，此板就可完全平妥坐入座架

10、中。比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反映仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全进程的孔），以 记录本次实验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），二者含义相同。通常的表示方式是，将吸收波长写于A字 母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方式为A492nm或OD492nm。 酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读 ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制

11、的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供给酶标仪。 酶标仪的要紧性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精准度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一样可精准到 01，准确性为1%，重复性达%。举例说，假设某孔测得的A值为，那么该孔相关于空气的真实A值应为 ），重复测定数次，其A值均应（）在之间。酶标仪 的可测范围视各酶标仪的性能而不同。一般的酶标仪在，新型号的酶标仪上限拓宽达，乃至更高。超 出可测上限的A值常以*over或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一 酶标仪的可测范围为，而其线性范围仅，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注

12、意。酶标仪不该安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在1530，利用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读 A值时，要选用产物的灵敏吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔前后测读两次，第一次在最适波 长（W1），第二次在不灵敏波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1，630nm为W 2，最终测得的A值为二者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各类酶标仪性能有所不同，利用中应详细新闻记者说明书。 结果判定 定性测定 定性测定的结果判定是对受检标本中是不是含有待测抗原或抗体作出 有无的

13、简单回答，别离用阳性、阴性表示。表示该标本在该测定系统中有反映。那么为无反映。用定 性判定法也可取得半定量结果，即用滴度来表示反映的强度，其实质仍是一个定性实验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进 行实验，呈阳性反映的最高稀释度即为滴度。依照滴度的高低，能够判定标本反映性的强弱，这比观看不稀释标本呈色的深浅判定为强阳 性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法 ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中那么相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反映的结果判定方式不同，分述于 下。（1） 间接法和夹心法 这种反映的定性结果能够用肉眼判定。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清楚

14、者为阳性。但在 ELSIA中，正常人血清反映后常可显现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必需加测阴性对 照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判定结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的 指标。目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，如此能够取得客观的数据。先读出标本（ sample，S）、阳性对照（P）、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。计算方式有多种，大致可分为阳性判定值法和标本 与阴性对照比值法两类。a 阳性判定值 阳性判定值（cut-off value）一样为阴性对照A值加上一个特定的常数，以

15、此作为判定结果阳性或阴性的标准。用此法判定结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必需标准化，阳性和阴性的对照品应符合必然的规格，须配用周密的仪器，并严格按 规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而取得的。现举某种检测 HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=92ng /ml。每次实验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数（NC X ）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（P-N）必需大于一个特定的数值（例），实验才有效。3个阴性 对照A值均应NCX，

16、并NCX，如其中之一超出此范围，那么弃去，罢了另两个阴性对照从头计算NCX；如有两个阴性对照A值超出以上范围，那么该次实验无效。阳性判定值按下式计算：阳性判定值=NCX+标本 A值阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是 对各类试剂都可通用。依照以上表达能够看出，在这种方式中阴性对照和阳性对照也起到实验的质控作用，试剂变质和操作不妥均会产生实验无效的后果。在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情形下，这种判定法较为适合。在得出标本（ S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。也有写作P/N的，那个地址的P不代表阳性（positi

17、ve），而是病人（pati ent）的缩写，不该误解。为幸免混淆，更宜用S/N表示。在初期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为 各类测定所沿用。事实上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血 清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反映后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此 ，这种试剂盒规，如N（或其他数值），那么按计算，不然将显现假阳性结果。（2）竞争法 在竞争法 ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反映中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一样调剂阴性对

18、照的吸光 度在之间，现在反映最为灵敏。竞争法 ELISA不易用自视判定结果，因肉眼很难分辨弱阳性反映与阴性对照的显色不同，一样均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。 计算方式要紧也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。a. 阳性判定值法 与间接法和夹心法中的阳性判定值法大体相同，但在计算公式中引入阳性对照 A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为1251 00u/ml。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值（NC X ）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必需大于一个特定的数值（例如）,实验才有效。3个阴

19、 性对照A值均应小于，而且应NCX并NCX，如其中之一超出此范围，那么弃去，而以另2个阴性对照从头计算NCX；如有2个阴性对照A超出以上范围，那么该次实验无效。阴性判定值=NCX+PCX标本A值阳性判定值的反映为阳性，A阳性判定值的反映为阴性。b. 抑制率法 抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反映显色的抑制程度，按下式计算：抑制率（%）= （阴性对照A值-标本A值）100%/阴性对照A值一样规定抑制率50%为阳性，50%为阴性。 定量测定 ELSIA操作步骤复杂，阻碍反映因素较多，专门是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一 系列不同浓度的参考标准品在相同的

20、条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一样较宽，曲线最高 点的吸光度可接近，绘制时经常使用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一样 呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部份是最理想的检测区域。测定小分子量物质经常使用竞争法（参见 ），其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的不同而略有不同。第二章ELISA技术中的抗原与抗体的反映抗体 抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白 （immunoglobulin,Ig）。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE

21、。与免疫测定有关的Ig要紧为 IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有（kappa）和（Lambda ）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链别离称为（gamma）链和（mu ）链。重链和轻链的 N端的氨基酸排列顺序因各类抗体而异，称为可变区，别离用VH和VL表示。二者组成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹 配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每一个Fab都保留结合抗原的能力，但只有一 个抗原结

22、合位点，是单价的，与抗原结合后不显现凝集或沉淀。另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解 成小分子多肽，无生物活性。IgM是由五个单体组成的五聚体，含 10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的阻碍，只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000， IgG分子量约为150000。机体被微生物感染后，先产生 IgM抗体，然后产生IgG抗体。通过一段时刻，IgM抗体量慢慢减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年 之久。IgM

23、抗体一样为爱惜性抗体具有免疫性。因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。右图为为甲型肝炎 病人血清中IgG抗体和IgM抗体显现的时刻和水平。 抗原抗体反映 可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的进程是一种动态平稳，其反映式为：Ag+AbAgAb抗体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，能够用平稳常数K表示：K=AgAbAgAbAgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上超级适合，二者结合牢固，不易解离。解离 后的抗原或抗体均能维持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中，特异性的IgG抗体仅

24、占总IgG中 的极小部份。用亲和层析法提取的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可取得更好的成效。 最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图1-4。曲线的顶峰部份是抗原抗体比例最适合的范围，称为等价带（zone of equivalence）。在等价带前后别离为抗体多余带和抗原多余带。若是抗原或抗体极度多余，那么无沉淀物形成，在免疫测定中 称为带现象（zone phenomenon）。抗体过量称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。在用免疫学方式测定抗 原时，应使反映系统中有足够的抗体量，不然测得的量会小于实际含量，乃至显现

25、假阴性。 特异性抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于二者在化学结构和空间构型上呈互补关系，因此抗原 抗体反映具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原（ HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体 反映。抗原抗体反映的这种特异性使免疫测定能在一超级复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物 。可是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部份相同的结构，在抗原抗体反映中可显现交叉反映。例如：绒毛膜促性腺激素（ hCG）和黄体生成激素（LH）均由和两个亚

26、单位组成，其结构的不同处在亚单位，而二者的亚单位是同类的。用hCG免疫 动物所得的抗血清中含有抗-hCG和抗-hCG两种抗体，抗-hCG抗体将与LH中的 酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG浓度较高的试验，否则 妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断（敏感度应达到50mIu/mlhCG）的实际中必须 应用只对hCG特异的抗-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。 灵敏性在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的灵敏度为 mg/ml水平，酶反映测定法的灵敏度约为510g/ml，免疫测定中凝胶扩散法和

27、浊度法的灵敏度与酶反映法相仿。标记的免 疫测定的灵敏度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其灵敏度可达 /ml。 免疫测定在临床查验中的应用由于各类抗原成份，包括小分子的半抗原，都可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原 ，因此免疫测定的应用范围极广，在临床查验中可用于测定：1） 体液中的各类蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。2） 激素，包括小分子量的甾体激素等。3） 抗生素和药物。4） 病原体抗原，HBsAg、HBeAg等。5） 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs等。5标记的

28、免疫测定如上所述，免疫测定是一种很灵敏的测定方式，抗原抗体反映后直接测定形成的沉淀或浊度，灵敏度可达 510g/ml，但在临床查验中，某些待测物在标本中的含量远低于这一水平，因此要寻觅增加灵敏度的方式。标记的免疫测定是 将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物来提高灵敏度。在放射免疫测定和酶免疫测定中，标记物别离 为放射性核素和酶，最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量，灵敏度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中， 一样加入过量的标记试剂以保证与待测物完全反映。以标记抗体（Ab ）检测抗原（Ag）为例，反映式如下：Ag+ Ab AgAb+ Ab 在反

29、映产物中有与Ag结合的Ab和游离和Ab ，如不将二者分离而测定标记物，测得的结果将为二者之和。因此，游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采 用多种手腕，固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上，然后再与标记的抗原或抗体直接反映，结合的标记物被固定在载 体上，而游离的标记物留于溶液中。如此能够通过洗涤将游离的Ab 除去，结合标记物的测定可在固相上进行。6酶免疫测定酶免疫测定（enzyme immunoassay）可分为均相（homogenous）和非均相（heterogenous）两种类型。在均相EIA中可 不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下，抗原抗体反映后形成的酶标记抗原抗体复