终稿葛根总黄酮超声提取Word下载.docx

1、 ultrasonic wave extraction; Radix Puerariae Lobatae; total flavonoids; extraction condition; uniform design.葛根总黄酮超声提取学生： 指导教师：正文1 前言葛根Pueraria是豆科：（或称蝶形花科）多年生落叶藤本植物野葛Pueraria Lobata Ohwi或甘葛藤（粉葛）Pueraria thomsonu Benth 的根或块状茎。葛属植物喜欢在阴湿向阳的环境中生长。葛藤可长达十几米，藤茎坚韧，外披棕褐色长硬毛；叶互生，有长柄，小叶三片，呈菱片卵形至阔卵形，具棕褐色绒毛；秋季开花

2、，花呈紫红色，蝶形；结扁平带状荚果，密生黄色粗硬长毛；块根粗大，肥厚，呈长圆柱形，黄白色或淡棕色，富含淀粉并有大量粗纤维。 葛根表面浅栗子色，亦称浅褐色，葛从曷，“褐”“曷”同音，药用其根，故名。从神农本草经记载其：“味甘，平。主消渴，身大热，呕吐，诸痹，起阴气，解诸毒。”后世医家在临床应用上着眼于本经所言，并在反复的临床实践中对其功效加以补充和完善。梁陶弘景名医别录认为其可以解肌、发表出汗，开腠理，疗金疮，止痛，胁风痛，其花可解酒；唐孙思邈千金翼方则突出其在风湿痹与时疫上的功用；宋寇宗奭本草衍义认为其可利小便，致下利；日华了本草则用其疗心烦闷，并认为其有排脓血、治毒箭所伤之功；元李杲珍珠囊补

3、遗药性赋又增加其可治湿疟；土好古汤液本草继承了张元素、李东垣学术思想，并在临床实践中指出其可补阳升津，疗头痛；明兰茂滇南本草多用以疗小儿痘疹，认为葛根可治疗头目晕眩、呕吐、解诸毒；陈嘉谟本草蒙筌记载其可疗小儿痞；李中梓本草证要以之疗疫喉；清汪讱庵本草易读认为其有除呕止泻、定喘、解郁、降冲逆之功；陈士铎本草新编认为其可散胃中之热、解肺中之燥；杨时泰本草述钩元记载其可治胁痛是发土气以达木气；凌央本草害利则言其生用可随胎，蒸之能散郁火。中药大辞典所载葛根功用：升阳解肌、透疹止泻、除烦止渴。第五版中药学教材所载葛根功用：发表解肌、升阳透疹、解热生津；2006版的临床中药学中葛根功效：疏散退热、透疹、生

4、津止渴，升阳止泻。故从目前有关中药学或中药辞典关于葛根功效的记载来看，葛根功效可概括为：升阳、止泻、生津、透疹、散热解肌等6个方面。葛根的主要有效成分为葛根素、大豆素、大豆苷等异黄酮类化合物，具有治疗心脑血管疾病、抗癌、舒张平滑肌、改善血液流变学指标、解酒及低毒性等药理作用。葛根异黄酮的提取方法很多，如醇回流法、醇渗漉法、浸渍法、超声辅助萃取法等，各有特点。利用超声辅助提取中药有效成分具有生产周期短、效率高、设备简单、成本低的优点。本文对利用超声辅助萃取法提取葛根总黄酮的工艺条件进行了研究，以提取率和提取物中葛根总黄酮的质量分数为指标，筛选了最佳的提取工艺条件。2 仪器与试剂2.1 仪器KQ-

5、200KDE型超声波清洗器（上海精密仪器仪表有限公司）；756型紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（嘉兴中新医疗器械有限公司）；R204B型旋转蒸发仪（无锡星海王生化设备有限公司）。2.2 材料和试剂葛根购自吉林省医药药材有限公司，粉碎后过40目筛备用。葛根素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：752-200209）；无水乙醇（南京化学试剂一厂，批号：040110058）；D101大孔吸附树脂（上海华羚树脂有限公司）；CaCl2（南京化学试剂一厂，批号：20020401）；氨水（南京化学试剂一厂，批号：200301001）。3 实验方法与结果3.1 实

6、验方法3.1.1 实验因素与因素水平的确立根据葛根总黄酮的理化性质，选取了乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取温度、超声处理次数等5个因素考察，采用DPS软件进行U15（1545）的混合水平均匀设计安排实验，因素水平及实验安排见表1。3.1.2 工艺流程葛根破碎超声提取过滤减压浓缩过柱水洗脱乙醇洗脱减压浓缩真空干燥总黄酮提取物3.1.3 葛根总黄酮的提取称取葛根干燥粗粉25 g，按照表1的实验设计加入溶剂，设定超声提取的时间、温度和超声处理次数进行提取。提取完成后，纱布过滤（多次超声提取时，合并滤液），然后常压滤纸过滤，减压浓缩至100 ml，加入适量蒸馏水，加1 g CaCl2，静置过夜，次日

7、离心。分别收集上清液，用氨水调pH至78，过D101大孔吸附树脂，蒸馏水洗去水溶性杂质，然后用80%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得葛根总黄酮粗品。3.1.4 葛根总黄酮的含量测定（1）标准曲线的制备：准确称取干燥至恒重的葛根素对照品10 mg于50 ml容量瓶中，加95 %乙醇至刻度，使之溶解。精确吸取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 ml于10 ml容量瓶中，用乙醇溶剂（95 %乙醇稀释10倍）稀释至刻度，摇匀；并以此乙醇溶剂为空白对照，在250 nm处测定吸光度，以吸光度为y、浓度为x进行线性回归，得回归方程：y = 4.1583

8、x + 0.1236，相关系数R=0.9997。（2）样品的测定：准确称取葛根总黄酮提取物5.0 mg于50 ml容量瓶中，加以上乙醇溶剂至刻度，摇匀使之溶解，并以此乙醇溶剂为空白对照，在250 nm处测定吸光度，根据吸光度-浓度回归方程计算样品中总黄酮的含量，然后按下式计算葛根总黄酮的得率：葛根总黄酮的得率（%）= 100%3.2 实验结果表1 均匀设计实验安排及结果Table1 The design and results uniform experiment实验编号No.X1X2X3X4X5Y水平Level乙醇浓度（%）Ethanol concentration乙醇用量（mLg-1）Vo

9、lume提取时间（min）Extraction time提取温度（）Temperature超声提取次数Treatment times总黄酮量（g）Total flavonoids得率（%）Yield1335816135211601.1800 4.72 210702293615801.5500 6.20 440206755451.2200 4.88 532301.1600 4.64 75141.2175 4.87 241.0875 4.35 95121.4500 5.80 50561.3725 5.49 8528251.3050 5.22 441.4300 5.72 9018481.5000 6

10、.00 26651.5575 6.23 1.1975 4.79 0.7125 2.85 3.2.1 回归分析葛根总黄酮超声辅助提取的实验结果见表1。以葛根总黄酮得率为因变量，各因素为自变量，采用DPS软件对试验结果进行多元线性和二次多项式逐步回归分析，得回归方程如下：Y = -1.744515 + 0.132514 X1 + 0.095781 X2 + 0.060151 X4 - 0.000878 X12 - 0.002380 X22 - 0.0000257 X32 - 0.000444 X42 + 0.0100016 X52 + 0.000410 X3* X5 （1）对回归方程（1）进行显著

11、性检验，其复相关系数R=0.9999，F值=8412.44（p0.01），该回归方程有显著意义。由于回归方程（1）中各回归系数单位不一致，不能直接比较，对回归系数标准化，得标准化回归系数见表3。表2 回归方程（1）的标准化回归系数Table2 The standardized regression coefficient of regression equation（1）因子FactorsX12X22X32X42X52X3*X5标准化回归系数Standardized regression coefficient3.39560.98171.5414-2.7336-0.8027-0.0347-1.

12、04610.10260.0336由表2可知，所选取乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取温度、超声处理次数等5个因素对超声辅助提取葛根总黄酮的得率都有直接影响，各因素影响强弱的顺序为：乙醇浓度（X1）提取温度（X4）乙醇用量（X2）超声处理次数（X5）提取时间（X3）。超声提取时间和处理次数不是最强的影响因子，这在理论上是合理的，因为超声处理只是一种辅助手段，与经典的提取方法相比，可以加快提取过程，但乙醇浓度、提取温度、乙醇用量才是决定浸出平衡时浸出液浓度的主要因素。3.2.2 超声提取工艺条件的优选根据回归方程（1），以葛根总黄酮得率最高为目标，根据实验经验，求得最优组合为：X1 = 75，X2

13、 = 20，X3 = 40，X4 = 68，X5 = 5。根据优化条件进行验证实验，制备3批样品，计算葛根总黄酮得率为：Y = 6.55%（n=3）。验证实验结果与回归方程计算结果相近，认为所选工艺合理、可行。3.2.3 超声提取法与传统提取方法的比较本文对超声提取法和传统提取方法提取葛根总黄酮进行了比较，结果见表3。由表3可以看出，索氏提取法虽然得率比较高，但耗时太长；乙醇回流法得率较超声提取法的低，而且溶剂用量大，用时较长。综合比较来看，超声提取法提取葛根总黄酮可以缩短提取时间，节约能源，而且操作简便，得率高。表3 不同提取方法提取葛根总黄酮效果的比较Table3 Comparation

14、of results of different extraction methods in total Radix Puerariae flavonoids extracting提取方法Extraction method提取溶剂Solvent溶剂用量（ml/g）提取时间（h）得率（%）（n=3）索氏提取法Soxhlet Extraction100%甲醇100%Methanol6.630.02乙醇回流法Ethanol Reflux Extraction75%乙醇75%Ethanol6.230.01超声提取法Ultrasonic Extraction0.676.524 结论与讨论有研究表明葛根总黄

15、酮提取方法可以采用水提，水提取溶剂价廉固然可行，但由于葛根中水提的同时其中富含的淀粉等杂质也会被提取出来，影响下一步分离效果，葛根总黄酮的提取也不如醇提法完全。本文采取大孔吸附树脂法分离纯化工艺简单，可行性好。有研究曾采用不同吸附剂如硅胶、氧化铝、聚酞胺、大孔吸附树脂分离葛根总黄酮，结果表明大孔吸附树脂相对于其他吸附剂对葛根总黄酮的分离效果好，故本研究采用大孔吸附树脂来对葛根总黄酮进行分离纯化，实验结果表明分离效果良好，可得到较纯的葛根总黄酮。从多元线性和二次多项式逐步回归分析看，乙醇溶剂浓度影响不仅一次项有较大的正影响，而且二次项有负影响，但是一次项系数远大于二次项系数，正影响为主，从数学上

16、需要较大的浓度。从提取理论讲，根据相似相溶原理，浓度不同对应的极性和溶解性都不同，由于葛根总黄酮主要基团相对极性较小，故用浓度大极性小的乙醇溶剂，选取75%乙醇溶剂。乙醇用量一次项影响为正，二次项影响为负，但一次项系数远大于二次项系数，故在此体系中稍大较好，以便充分分散，促进提取，但是太大会使后续浓缩工作量显著增加，故选择20ml/g即可。提取时间影响比较复杂：有二次项的负影响，与超声提取次数交互正影响，正影响系数大于负影响系数，这就要求提取时间可以较长，但由于自身二次项有一定负影响，故不能太大。另外根据提取理论，超声主要目的是产生“空穴”等效应起作用，而由于负压的“空穴”作用时间一般比较短，

17、故在一定时间后粉碎植物细胞壁效果增加就很有限了。故本文选用40 min。提取温度一次项为正影响，二次项为负影响。一次项系数大于二次项系数，所以适当提高提取温度，有利于提高得率。但是提取温度不能过高，用水提取温度保持亚沸状态。避免温度过高有用成分的破坏，同时也部分减少了无用成分如淀粉、胶质类成分的溶出。故提取温度选择68。超声提取次数的一次项系数为正，与提取时间也有交互正影响，所以应该提取次数越多葛根总黄酮得率越高。但是考虑随着提取次数的增加葛根总黄酮得率变化逐渐平稳，大概5次提取后得率增加不再明显，故选取超声提取5次。综上所述，影响超声辅助提取葛根总黄酮的主要因素有乙醇浓度、乙醇用量、提取温度

18、、提取时间和超声处理次数，各因素对葛根总黄酮得率的影响强弱顺序为：与传统提取方法相比，超声提取法提取葛根总黄酮具有省时、节能、操作简便、得率高的优点。通过对回归方程综合分析，得出最优工艺条件，对优化结果的验证实验表明，优化出来的工艺条件较均匀设计表中的其它工艺条件更为优越。说明采用均匀设计方法，不仅可以有效地指导实验，还能有效地进行中药有效成分提取工艺的建模和工艺条件优化。参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典S.2005版一部.北京：化学工业出版社,2005：233.2 蒲自和,王宁.葛根的药理学研究进展J.西北药学杂志,2000,15（2）:81-83.3 潘洪平.葛根总黄酮和葛根

19、素的药理进展J. 广西医学,2003,25（10）:1941-1944.4 戚本明,蔡春春,邓小明,等.葛根总黄酮对卵巢切除大鼠鼻黏膜上皮细胞凋亡的保护作用J.中国中药杂志,2005,30（11）:855-857.5 陈国钧.超声技术在中草药有效成分提取中的应用J.机电信息,2005,（18）:56-58.6 高凤英.葛根素药理作用的研究进展J.中草药,2003,12（34）:7-8.7 茅彩萍.葛根素的药理作用和临床应用研究J.中国血液流变学杂志,2004, 14（1）:138-143.8 刘青,周金海.葛根的临床应用J.中国临床医生,2003,31（2）:55-56.9 李翠莲,方北曙,姜

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21、t of puerarin on neural function and histopatholyical damages after transient spinal cord ischemia in rabbits. Chinese Journal of Technology J, 2004, 7（3）:143-147.综述葛根的研究进展摘要：葛根为豆科葛属多年生落叶藤本植物野葛Pueraria lobata（Willd.） Ohwi和多年生落叶藤本植物甘葛藤P. thomsonii Benth.的干燥根。化学成分含有：异黄酮类、其他黄酮类、香豆素类、三菇类化合物等，其中主要为异黄酮类。葛

22、根是中医常用的祛风解表药之一，具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻等功效。主要用于外感发热头痛，高血压颈项强痛，口渴，麻疹不透，热痢，泄泻等症。化学成分；药理作用1 生药学研究 葛根始载于神农本草经，列为中品。神农本草经及本草纲目有用葛根治消渴、身热和诸痹等症的记载，伤寒论中记述可用葛根治疗项背强痛、目痛及口渴等症。陶弘景谓：“即今之葛根，人皆蒸食之。当取入土深大者，破而日干之。”陈藏器谓：“根堪作粉。”李时珍谓：“其根外紫内白，长者七八尺。其叶有三尖，如枫叶而长，面青背淡。其花成穗，累累相缀，红紫色。其芙如小黄豆英，亦有毛。”豆科葛属植物分布在亚热带的有30余种，我国约有10种，包括野

23、葛Pueraria lobata,山葛P. lobata var. montana、峨嵋葛P. omeiensis、粉葛P. thomsonii、食用葛P. edulis、密花葛P. palopercuroides、黄花葛P. calycina、三裂叶葛P. phaseoloides、云南葛P. peduncularis及小花葛P. strizcta等。其中，野葛以其根部入药，称为葛根。2化学成分研究 有关野葛的化学成分研究较多，主要从中分离得到以下几种类型化合物：异黄酮类、其他黄酮类、香豆素类、三菇类化合物等，其中主要为异黄酮类。2.1黄酮类化合物2.1.1异黄酮自1927年佐佐木研究葛根至今，对葛根的研究己有80年的历史。Kinjo等人率先对野葛的化学成分进行了系统研究，得到了15个异黄酮类化合物：葛根素、大豆苷元、大豆苷，葛根素-木糖苷。葛根素是首次从葛根中分得的异黄酮碳苷，随着进一步的研究，又有大量的异黄酮氧苷和碳苷从葛根或其茎、花中分得，包括：染料木素、染料木苷、芒