关于引物设计Word文档下载推荐.docx

1、在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm值等。特异性（Specificity）在specificity ch

2、eck区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了4种数据库：RefSeq mRNA, Genome （selected reference assemblies）, Genome （all chromosomes）, and nr （the standard non-redundant database）。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准 来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference as

3、semblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。实例分析用人尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374）的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1的序列长一点（NM_003362），UNG2的序列短一点（NM_080911，注：拿这两个基因的序列ClustalW一 下就可以了）。这里用UNG2的序

4、列设计引物，选择RefSeq mRNA database，物种是Human，其它默认。结果如下图A-B所示，设计的引物只能扩增出UNG2。看上面的图，把“Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上，出现的结果如下图-C所示，新的引物也可以扩增出UNG1（注：我试了一下，不能得到预期的结果，可能参数没设对）。Figure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBI Reference sequence NM_080911 was used as a temp

5、late. Top panel: Primers specific to the single splice variant are reported by default with the mRNA RefSeq database limited to human sequences. Bottom panel: Primers that amplify both splice variants are found with the option to allow splice variants.（点击看大图）一些Tips1，在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession 号（尽

6、量不要Fasta格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填Accession Number时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用Gi号或Accession 号（Primer-BLAST有参数可以设置设计引物的范围，”Form-To”，如上面的第一幅图所示）。因为用Gi号或Accession 号，NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。3，尽量使用没有冗除的数据库（如refseq_rna 或 genome database），nr数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。4，请指定

7、一个或几个PCR扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。3. 点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项（引物设计流程pdf）4. PCR primer design一书要精看 5. 在NCBI上使用BLAST等工具的心得（包括了利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子）6. Primer5中文手册7. oligoOligo 6.22 使用技巧简介1. 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始

8、界面是两个图：Tm 图和G 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下：图中显示的三个指标分别为Tm、G 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6 至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows 菜单改为tili 方式。如果觉得太拥

9、挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左 下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选 取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。?G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的?G 值在5端和中间值比较高，而在3端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线 为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率

10、大小。选取引物时，宜选 用3端Frq 值相对较低的片段。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或 下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低， 因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。 当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，

11、引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹 结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55为宜。有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游 引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基 因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PC

12、R 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的 模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并 不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求 去寻找最佳引物，如果参数

13、设置得当将大大提高工作效率。Oligo6.0软件教程Oligo使用方法介绍作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：1， 直接用键盘输入：a， 点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；b， 此时即可键入DNA序列；c， 如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边

14、读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。2， 利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。3， 如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。进入引物设计模式后

15、，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5端稳定性是否稍高于3端等。一，普通引物对的搜索：以Mouse 4E（cDNA序列）为例。我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600800bp长的PCR产物。1，点击“Search“菜单中的”For Pr

16、imers and Probes“命令，进入引物搜索对话框；2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs。在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3端高度特异，GC含量有限定，d，去除错误引发引物等。3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。单击：“search Ranges”按钮，弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：12000，下游引物的位置：1002300；PCR产物的长度600800bp。单击“Paramaters”按钮进入“Search Pa

17、rameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：不同设定，参数以及更多参数。在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选项。当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定Very high/High等来完成对引物设计参数的设定。当我们选中“Automatically Change String”后，Oligo会在引物搜索过程中：如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。在设计反向PCR引物对时，就选中“Inverse PCR”复选框。我们还可以让引物的长度可以改变，以

18、适应设定的Tm值或PE？（Prime Effitions，引发效率）。也可以限定所选引物对的最大数目。在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如23nt。其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。在“More Parameters“窗口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。4，点击“确认”“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并出现一个搜索结果窗口。显示出得到的引物对数目。5，点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，产物长度，最

19、佳退火温度及GC含量。单击“Sort”按钮，可以按产物长度，最佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。6，点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对引物在模板中的大概位置，最佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火）。另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在56度以内。点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。7，要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等，这时只需点击“

20、Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。例如点击“Duplex Formation”，我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。同理，“Hairpin Formation”，“Composition and Tm”，“False Priming Sites”等命令就可以显示出相关信息。所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择最佳的引物对。需要说明的是，1，如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数；2，引物一般尽量不要在3端或是离3端太近的位置形成二聚体，同时二聚体的自有能

21、绝对值尽量小于10；3，对于错误引发，在普通PCR中，如果引发效率在160 points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该严格控制在120 points以下。8，Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：首先点击“File”菜单中的“Print/Save Options”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；在“Analyze I”中选择需要保存的信息，在“Analyze II”中选中PCR。单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“Data Save as”，选择路径及文件名即可。二，测序引物的设计：在olig

22、o中，测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。还是以Mouse 4E为例，假如我们要在600800bp的位置设计一条测序引物。OpenSearch在“Search”窗口中，选中“Sequece Primer”，同时去除负链Search的选中在“Search Range”窗口，输入正链的600800bp在“Parameters”中选定 very high ，引物长度改为18bp结果得到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序引物。三，探针的设计：探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长度就可以。四，评估引物对：

23、我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR，往往很难重复别人的实验结果。这时就想到，是不是引物的质量有问题？能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？答案时肯定的。1，点击File菜单中的New命令；2，在“Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物；3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5端位置数字，如20；4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；6，选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；7，从Edit菜单中选取“Lo

24、wer Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列；8，在Edit窗口的上角处，输入相应的5位置；9，选取“Accept and Quit”命令；如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44。10，点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。心得yvette wrote:对于作PCR的来说，最难的莫过于设计引物了，理论现在已经很多了，但是真正实践起来是要付出一定的心智的，记得曾经看到某一位主任说他设计了上千对引物，从没有失手的时候，真是让我佩服得五体投地。最近看了一下OL

25、IGO6.0的使用说明，英文的，感觉有很多地方还是讲得不很明白，比如 Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design.下面我先来讲讲普通的利用OLIGO 设计引物的方法吧：1 从文件菜单打开模板序列，当然，不是随便什么序列都可以打开的，要有特定的格式，一般扩展名为 *.seq的序列可以直接打开，或者就从文件菜单选择new sequence打开一个空窗口，然后利用复制/粘贴也可以导入模板序列，或者直接在该窗口中写，然后要打开文件菜单旁边的 accept 菜单，选accept就可以了；这时候有三个窗口，重叠在一起，很不方便看，可以从windo

26、w菜单选Tile，这样，三个窗口就平行排列了。2 从search菜单选primers and probes，打开了引物搜索窗3 点黑PCR下面的compatible pairs 前面的小圆孔4 在oligonucleotide with GC clamp 及 Eliminate false priming 前的小方格里打上勾5 如果在PCR中可能存在其他的模板，要想使所设计的引物与该模板不会形成错配，可在 And continue above search in other files 的条目前方格中打勾，这时会出现一个新的 select files窗，导入可能会形成错配的模板序列。点OK6

27、点Search ranges按钮，输入你想要的上游和下游引物在模板序列上的区间及想要的产物的长度，点OK7 点parameters 即引物参数按钮，一般将搜索严谨性设为high，如果搜不到，再降低严谨性，另外，在adjust length to match Tms前的方格中打勾。8 点击OK开始自动搜索9 搜索完成后，在search status窗口的下部选show:primer primers, 点OK10 得到的引物可以根据位置、长度、退火温度及GC含量进行排序（sort）11 点击您所想要的就打开了一个窗口显示引物的位置、退货温度、GC含量、PE（Priming efficiency 引

28、发效率）等。12 从文件菜单点击New Database ，然后从import菜单点击 upper primer 和lower primer 就可以将您所需要的上下游引物序列导入到数据库中，至于如何生成引物报告单我就不甚了了，感觉这个功能不如primer premier好使。还希望知道如何使用的兄弟不吝赐教一下叻。Nested Primer pairs Search 与上述自动搜索差不多，有一下几点不同：1 打开search菜单后，不要选定 “ And continue above search in other files ”2 打开parameters菜单后，注意不要选定“ Inverse

29、 PCR” 框 ，同样选定“adjust length to match Tms” 框3 开始搜索后得到结果显示在“Primer pairs窗口中，从analyze菜单中 选定multiplexing,得到一个显示所有搜索到的引物在模板上的位置的窗口，直接在该窗口中选择您所要的引物，在您所要的引物的小方块上点击一下，positive strand primer 选定后就从红色变成了绿色，negative strand primer 选定后就从蓝色变成了绿色。先选择巢式PCR的一对外引物，然后选择一对内引物，选定后点击pairs就打开了显示您所选定引物的窗口4 从文件菜单点击 ，然后从import菜单点击multiplexed primers就将您所选定的引物导入到一个数据库中，保存。好像从export 菜单可以生成order form, 但是我实在是太木了，这都大功告成了，到了最后又歇菜了。还有很重要的功能如搜寻 consensus primer pair 和搜寻 unique primer pair 来扩增同源性的模板，比如后一个应该就是设计扩增许多同源性很高的序列的保守区吧，我以为我已经找到了尚方宝剑了，可是三条序列试了一下，这三条序列