第四章 现代液相色谱分离技术文档格式.docx

1、 进样器 自动进样装置 样品 固定相 温度控制器 记录仪 积分仪 馏分接收仪 数据处理器（工作站）图4-1 现代液相色谱仪结构框图413 输液系统 高压泵是现代液相色谱仪的关键部件之一，其功能是将贮液器内的流动相以高压的形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。泵的性能优劣直接关系着整个分析结果的可靠性，为得到好的分离效果，对泵有以下严格要求， 输出压力高：150-300公斤/平方厘米柱入口压力，最高输出压力应达到500公斤/平方厘米。 流量范围广：分析型的在0.1-10ml/min，制备型的在10-100 ml/min。 流量稳定：流量重复性和精度在0.5%左右。 耐腐蚀：适

2、合于各种溶剂、缓冲溶液。 其他：密封性好，泵室体积小，便于清洗，便于实现梯度洗脱。 1.气动泵是最简单的高压泵，是现代液相色谱中应用最早的一种。它是以高压气源为动力，调节气压可以调节流量。应用较多的是气动放大泵，根据压力传导原理设计制成的，主要部件由汽缸和液缸组成。 2.往复柱塞泵这是目前用的最多的一种，它由液缸、柱塞、单向阀、驱动机构组成，见图4-2。 活塞 色谱分离柱 偏心轮 单向阀 密封环 贮液器 图4-2 往复柱塞泵 这种往复泵的往复频率较高，100次/min，所以对其密封垫和单向阀的刚度、精度、耐磨性要求很高，密封垫一般由聚四氟乙烯-石墨制成，而单向阀的阀球、阀座、柱塞则由人工红宝石

3、材料制成。泵体的结构决定了泵的基本性能，如输液能力、稳定性、重复性等。为了获得高稳定性、重复性的输液效果，现在多采用多泵头结构。例如3多泵头高压泵就是三个泵头间有120度的相位差，所以流量的波动得到了补偿，减小了脉冲。双泵头可以组成串联和并联（180度的相位差）两种形式。414 进样系统 进样系统是将样品送入色谱柱的装置，目前常用的方式是阀式进样。高压进样阀是现代液相色谱仪的优良进样装置，通常采用带有定量管的六通阀。它的优点是进样量可变范围大，进样量大，重复性高，分析和制备通用。缺点是死体积大，容易引起峰变宽，制造工艺要求高。 六通阀通常由阀体、阀芯、定量管组成。阀体用不锈钢制成，内壁精密加工

4、。旋转密封部分由坚硬的铝合金陶瓷材料或耐磨的聚四氟乙烯材料制作，既耐磨又有良好的密封性。操作分两步骤进行（见图4-3），当阀处于装样时，1和6，2和3连通，样品从4（针孔）位置进入定量管，多余的从6排出；当阀处于进样时，将阀芯顺时针旋转60度，这时，1和2，3和4，5和6连通，贮存于定量管中的样品在流动相的带动下，进入色谱柱，实现分离。 泵 1 2 6 3 色谱柱 装样状态 5 4 针孔 6 3 色谱柱 进样状态 5 4 图4-3 六通阀进样步骤 第二节 液相色谱柱现代液相色谱的发展与色谱柱技术的突破密不可分的。色谱柱是色谱仪的重要附件之一，是色谱仪的心脏。现代液相色谱柱分为常规、快速、微径柱

5、等，其主要参数列于表4-1。表4-1 现代液相色谱柱主要参数柱类型管内径（mm）柱长（cm）填料粒径（微米）流速（ml/min）检测池体积（微升）常规快速微径2-50.5-110-503-510-305-1031-30.5-20.1-1101421 色谱柱的结构 1色谱柱材料与尺寸 为了能够耐高压、耐腐蚀，色谱柱一般采用优质不锈钢制成。不锈钢的内壁必须进行精细的抛光处理（光洁度要求在8以上）， 若内壁有纵向沟槽或光洁度不够，均会引起波谱峰的变宽，使柱效下降。 对于现代色谱而言，色谱柱的规格一般为10-30cm长，内径为2-5mm，所装填料（或称固定相）颗粒在3-10m之间。管径明显影响柱效，因

6、为组分在柱内不仅存在纵向扩散，而且存在径向扩散，特别是当流速较慢时，径向扩散更加严重，使峰展宽。一般而言，柱长应不小于柱径的10-20倍，柱径应为粒径的60-80倍。2. 滤片、柱接头、连接管 色谱柱两端的接头是为了通过连接管与色谱系统相连接，在接头内要装上不锈钢烧结滤片，柱出口端的滤片是为了挡住固定相，防止其六如检测器或堵塞管路。滤片的空隙度要小于固定相的颗粒粒径。 柱接头和连接管不仅要耐腐蚀，更重要的是死体积小，进样器与柱，柱与检测器之间的连接管的直径要小于0.25mm。422 色谱柱填料的一般特性 填料的特性决定了色谱柱的性能。填料的热力学特性影响色谱柱的选择性，填料的结构特点决定了色谱

7、柱的柱效率，这在第二章中已经涉及过。总之，从Van Deemter速率方程可以看出，无论从停滞流动相的质量传递，或者从涡流扩散和流动相质量传递来考虑，填料的粒径小，均有助于提高柱效。 1. 表面多孔型（薄壳型）填料 表面多孔型（Superficially porous）或薄壳型（Pellicular Bead）填料（图4-4）是为现代液相色谱设计的第一种优质填料，多用在20世纪60、70年代。这种填料的中心是一个惰性的硬核，在核的表面包敷一层很薄的多孔物质，如硅胶、氧化铝、聚酰胺、离子交换树脂等，也可以是键合固定相。它的粒径通常在20-40m，比表面积在1-15m2/g，孔径在100-500埃

8、之间。其机械强度高、渗透性好、传质速度快，柱效较高。 1-2m 核内深坑实心核 表面多孔型 球型 全多孔型 图4-4 液相色谱填料类型 2全多孔填料 包括球形和无定形，直径在3-10m，比表面积为60-600m2/g，孔体积在0.2-2ml/g之间。改善了固定相和停滞流动相的传质速率，提高了柱效。 小颗粒粒径对提高柱效非常有利，但是柱压也会急剧增加，因此要在较低的柱压下操作，必须减小柱长度。此时也可提高分析速度。423 色谱柱的装填方法分干法和湿法两种。对于粒径大于20m的填料来讲，采用干法，小于20m的填料，采用湿法装填。湿法也叫匀浆法，即以一合适的溶剂为分散介质，经超声波分散、脱气处理后，

9、形成匀浆，然后在高压下将匀浆压入色谱柱，即完成了装柱过程。匀浆法有平衡密度法、非平衡密度法、高粘度法，不论采用哪种方法，目的是尽量减低填料颗粒的自由沉降速度，保证填充均匀。目前通常采用第二种方法，即选用环己烷/二氧六环或四氯化碳/二氧六环作溶剂。装填的压力在350-450 kg/cm2的水平上，见图4-5。 高压阀 匀浆罐 气压表 色谱柱 气动泵 图4-5 色谱柱填充装置423色谱柱的性能评价 对一根色谱柱无论是自己装填的，还是购买的，在使用前都应进行评价。柱性能的评价标准虽然并不统一，但是应主要从动力学角度考虑。表4-2列出了评价不同色谱柱所用的测试物质。表4-2 评价不同色谱柱所用的测试物

10、质测试物质流动相吸附柱苯、萘、联苯己烷反相柱甲醇/水（8：2）氰基柱甲苯、苯乙睛、苯乙酮己烷/异丙醇（98：氨基柱联苯、硝基苯庚烷醚基柱邻间对硝基苯胺己烷/二氯甲烷/异丙醇（70：30：5）1. 柱效 根据塔板数的公式计算。 2.计算色谱的对称性 10%峰高处A/B的比值。 3. 孔隙率 为色谱柱的自由截面积与实际截面积的比值。 =4Ft0/Ldc2 （4-1）dc为柱内径。 4. 渗透性K0 K0= Lu/P （4-2）P为柱压降。第三节 检测器431 紫外吸收检测器 该检测器是液相色谱使用最广泛的一种检测器，几乎所有的液相色谱仪都配有紫外检测器。它对温度和流速不敏感，适用于梯度洗脱，选用无

11、紫外吸收的溶剂作流动相，用于有紫外吸收的物质检测。它遵循郎伯-比耳定律，即， A= C l （4-3）为摩尔吸收系数，l为样品池的光路长度。 按光路系统分有单、双光路两种，按波长分有固定和和可变波长两种。常用的固定波长有214、230、254、280nm。检测池的体积和构型直接影响柱效和灵敏度。标准的池体积为5-8l，光程5-10mm。常用的流通池的形状为Z和H形，见图4-6。 光 流动相 流动相 Z形 H形 图4-6 常见紫外检测器的样品池432 荧光检测器它是一种高灵敏、高选择性检测器，可检测有荧光的物质。很多生化物质包括某些代谢产物、药物、氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物都有荧光，可用该

12、检测器进行检测。具有某种特殊结构的化合物，受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的光线，一般在可见光线范围内。这种光线叫做荧光（Stokes荧光），波长较短的光线叫激发光，波长较长的荧光叫发射光。荧光检测器测定的是物质的荧光强度F，F=2.3QKI0Cl （4-4）Q为荧光量子效率，K是荧光收集效率，I0是入射光强度，C为组分的浓度。该检测器分多波长和分光光度两种，前者用滤光片单色器，后者为光栅单色器。荧光检测器的光源通常为山灯，它可以在250-600nm的范围内发出连续光谱，经单色器分光后，选择合适的波长作为激发光，激发光进入样品池后，样品受激发后在垂直激发光的方向上发出荧光，由光电倍增管接收放大。433 示差折光检测器 示差折光检测器是通过连续地测定流出液的折光指数变化来测定样品浓度，它的灵敏度与溶剂和溶质的性质有关，其响应信号由下式表示， R=Z（n-n0） （4-5）式中，Z为仪器常数，n为溶液的折射率，n0为溶剂的折射率。根据稀溶液中的相加定律，溶液的折射率等于溶剂和溶质各自摩尔浓度之和， n=C0n0+Cini （4-6）Ci是溶质的摩尔百分数，C0是溶剂的摩尔百分数，ni为溶质的折射率。因为C0+Ci =1，所以， n=（1-Ci）n0+Cini =