多糖化学结构鉴定方案总结Word文件下载.docx

1、再用相同体积的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;最后用相同体积的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至pH值中性。处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/LNaCl溶液,去离子水依次分别平衡（流速1.0ml/min）2一3个柱体积备用. 糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DEAE一52一纤维素阴离子-1层析柱（2.6x30cm,Cl型）,分别采用去离子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液进行分段梯度洗脱,流速1.0ml/min,自动收集器分部收集（10ml/管）,每梯度2

2、0管。用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量（490nm处吸收值）,以收集的管数为横坐标。吸光值（490nm）为纵坐标绘制DEAE一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除NaCI及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得初步纯化产品。初步纯化多糖得率计算公式:多糖得率（%）=纯化多糖质量/粗多糖质量x100% 葡聚糖凝胶层析纯化 采用Sephadex G-100凝胶层析法对DEAE-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化。葡聚糖凝胶（sephadexG一100）的预处理:称取sephadexG一100凝胶干粉,加入30倍体积质

3、量比（ml/g ）的去离子水,沸水浴5小时使其溶胀。冷却后用去离子水反复浸洗,减压脱气后进行湿法装柱,用0.1MNaSO;溶液平衡（流速0.25ml/min）2一3个柱体积备42 用。分别称取经DEAE一纤维素一52初步纯化的各多糖组分样品20mg,溶于2 ml 0.1 M NaSO溶液中,上样于SephadexG一100层析柱（2.6x60cm）用0.1MNaSO溶液溶液洗脱,流速44220.25 ml/min,分步收集（5ml/管）。 用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量（490nm处吸收值）,以收集的管数为横坐标。吸光值（490nm）为纵坐标绘制sePhadexG一100色谱柱洗脱曲线。依

4、据洗脱峰型,合并相同组分,50旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除NaSO;及小分子杂质,最后将透析内液冷42冻干燥,得不同纯化产品。纯化多糖得率计算公式:纯化多糖得率（%）=纯化多糖质量/粗多糖质量x100% （鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖） （4）纸层析法呈单一集中斑点。取0.5%的多糖样品溶液50ul,点样于新华中速滤纸（3cmx20cm）距端点1cm处的中部,以正丁醇:浓氨水:水（4O:50:5）为展开剂,饱和2小时以上,在室温下展开6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺蓝液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一个清晰的斑点。（5）琼脂糖（Agarose）凝胶电泳法 在琼脂糖板（厚

5、度为0.2cm）上点样3一5ul采用浓度为0.075mol/L,pH8.6的巴比妥缓冲液,电泳1-1.5h,电压为64一80V,甲苯胺蓝（浓度为1%）染色,醋酸乙醇混合溶液（醋酸:乙醇:水=0.1:5:5）脱色。多糖纯品经电泳展开后,看是否呈现单一斑点,斑点是否清晰。（6）紫外分光光度法 将多糖PWZ加0.9%NaCI溶液溶解,配成浓度为1mg/ml的溶液,采用UV一16OA紫外可见光谱仪扫描（200nm一30Onm）观察260nm、280nm处是否有吸收峰。多糖的分子量测定：过去用超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法等，这些方法操作复杂且误差较大，现已少用。现在较常用的方法有凝胶过滤法

6、和高效凝胶液相色谱法，这两种方法须先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。 一般来说，多糖结构分析包括以下几点：（1）单糖组成分析：研究确定单糖的种类及摩尔比；完全酸水解后用高效液相色谱方法（HPLC）或气相色谱方法测定。（2）糖苷键类型：研究确定糖苷键及支链点连接位置；甲基化分析方法 高碘酸氧化法与Smith降解法 （3）糖环大小：研究确定糖苷键为呋喃糖或吡喃糖； 红外光谱 （4）异头碳构型：研究确定糖苷残基的a-或P-构型； 2D NMR.（Two dimensional Nuclear Magnetic Resonance）光谱分析方法测 （5）确定单糖残基和重复单元的序列 甲基化

7、分析方法与磁共振光谱分析方法结合分析，一般会参考多糖的单糖组成及摩尔比信息以利于解析多糖结构。高碘酸氧化法 薄层层析（TLc）定性， 气相色谱法 0-磷酸化，乙醜基取代，0-修饰基团的种类和取代位点，如0H-）取代基团位点：研究6（硫酷化等； 比色分析方法 （7）多糖分子量分布的研究。紫外光谱 定性与定量方法 薄层层析：残基定性 气相色谱：残基定量 气质联用：高效阴离子色谱法：鉴定结构常用物理化学方法：高效液相色谱:确定单糖组分和相对分子量 红外光谱分析:测定多糖的官能团，不仅可以检测酮糖、酵糖的耻喃糖环或呋喃糖环的构象和糖苷键的构型 核磁共振:-构型与-构型残基的比例；判断异头碳构型；推断主

8、链和支链连接键型 鉴定结构复合方法：甲基化分析:推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例 高碘酸氧化法与Smith降解法:判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目 糖睛乙酸酷衍生物的气相色谱法:单糖组成和摩尔比 各种多糖化学结构鉴定方法的具体实施方案 1、酸水解 （1）完全酸水解 -1 称 取 20mg 样品 , 加入 2mL 2molL的HSO于安培管中沸水浴水解 8h, 水解液用 42BaCO中和至pH =7 , 离心 , 取上清夜置冰箱冷藏备测 。（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化3及其化学结构的初步研究） （2）部分酸水解 称取糖样 70mg，80条件下，0.05M

9、三氟乙酸水解 2h。降至室温后，离心（4000r/min，10min），将沉淀干燥，留做 GC 分析。上清用无水乙醇除酸至中性（pH 为 67），蒸馏水透析 48h：将袋外透析液浓缩，真空干燥，留做 GC 分析；袋内液浓缩至 5ml 左右，加 10 倍体积无水乙醇，醇沉过夜，离心（4000r/min，10min），沉淀常规干燥，作 GC 分析；上清浓缩， 真空干燥，留做 GC 分析。2、高效液相色谱 确定样品的单糖组成 色谱条件为 :色谱柱为Shodex KS804 Sugar（300mm 7.8mm） 柱温40度 流动相为水 -1 流速0.8mLmin检测用 410R示差检测器，数据处理用8

10、10GPC软件进行。种单糖进8同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖行对照, 根据峰值确定样品的单糖组成。分子量的测定以标准分子量的葡聚糖 Pulluan 作分子量测定标准。让其通过高压液相色谱柱, 条件同上, 先以分子量对数与对应的保留时间作标准曲线, 从标准葡聚糖Pulluan 的工作曲线上可以求得该成分分子量 。例如：（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究） 将水解后的多糖样品PW2进行HPLC分析,结果如表所示:阿魏侧耳子实体多糖PW2经过酸水解后,得到2种单糖:葡萄糖和半乳糖,摩尔比例1.771。4经HPLC测定后对照标准曲线得多糖PW2的分子

11、量为3.1810。4、甲基化分析 （1）基本原理 先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，然后将多糖中的糖苷键进行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例，可以推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例。 用此种方法得到的羟基及NaBH还原醛基后产生的羟基，经乙酰化可得到甲基化的糖醇4乙酸酯（此产物易挥发，可进行GC分析），再经GC与GC-MS分析，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱谱图的主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。 反应通式如下:（2）甲基化反应 取充分干燥的多糖样品10 mg，溶解在2.0 ml的二甲

12、基亚矾（DMSO）中。在N2保护下快速加入干燥的NaOH粉50 mg，用N排出空气，加盖密封，室温反应1.0 h并间歇振荡。2在N保护下缓慢滴加碘甲烷1.0 ml，用N排出空气，加盖密封，室温继续反应1.0 h并间22歇振荡，反应完成后加0.5 ml水终止反应。反应液先用自来水流水透析48 h，再用蒸馏水透析24 h，透析液冷冻干燥得第一次甲基化样品。第一次甲基化样品继续甲基化，反应步骤3700 得第二次甲基化样品。如此重复甲基化三次。甲基化后的样品用红外光谱检测，同上，-1-1，附近无羟基的特征吸收峰，表明甲基化反应完全。 3100 cmcm（3）甲基化样品的衍生化 上述完全甲基化多糖样品加

13、入2 mol/1的三氟乙酸（TFA ） 3.0 ml, 120密闭水解2.0 h。冷却后50减压蒸发干，加2.0 ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干得完全甲基化多糖的水解产物。加蒸馏水2.0 ml使其溶解，再加硼氢化钠25 mg，振荡后室温还原反应2.0 h。反应完后滴加0.1 mol/1醋酸分解过量的硼氢化钠并调pH值至5.57.0弱酸性。反应液50减压蒸发蒸干，加2.0 ml甲醇再蒸干，重复三次，最后蒸发干。 上述蒸发干样品加入1.0 ml醋酸酐和1.0 ml吡啶，封管后在沸水浴中反应1.0 h。反应液50减压蒸发干，加2.0 ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干。加入丙酮1.0 ml，用0.45ul尼龙微孔滤膜过滤，取样进行GC/MS分析。（4）衍生化样品的GC/MS分析 多糖样品经甲基化、水解、还原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，进行GC/MS联机分析，根据文献的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片（m/e），推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例。本实验采用的条件为:GC （ Varian CP3800型）和MS （Varian Satum 2200型）气相一质谱联用仪，DB-5MS石英毛细管柱（30 m X0.25 mm X0.25um）;程序升温，初温80，保持1 min，以8 /mi