第二章药学生物科技PharmacobiotechnologyWord文件下载.docx

1、生物科技在1973年是由赫伯特 Boyer和斯坦利Cohen研發出基本的技術；他們把去氧核糖核酸（基因）可以從一個有機體移植到另一個生物，形成新的重組的有機體。雖然去氧核糖核酸的結構在有機體之間轉移時沒有改變，但能明確地轉移一個具體片斷的去氧核糖核酸和控制它的表現顯然是種新的嘗試，並且它在分子生物學和生物科技的潛力（發展）也迅速被科學界認可。這套基因複製技術雖然是Boyer和Cohen根據其他科學家發現的一定程度的分子生物學酵素和其他工具完成的，但是他們是彙集全部資料才完成這革命性的設計。這種科技的發展，在1978年時，第一種遺傳工程生產的胰島素已經開始被使用。幾年以後，許多新的生物科技產品也

2、陸續問世。在1994的美國製藥研究報告中，指出市面上已經出現21種從重組合去氧核糖核酸技術製造和經過超過150種各式各樣的臨床試驗的產品。更重要的是，對於那些無法被醫治的疾病，在將來也許生物科技可以研究出更多新種類的療法或開發出更多新藥，這都是無可限量的榮景。生物科技的工具重組合去氧核糖核酸（rDNA）是被修建的外部活體細胞，使用稱限制酶（retriction enzyme），它在特定位置切開去氧核糖核酸和酵素；叫合成酶 （ligase） 插入被分裂的去氧核糖核酸片段（the insert）進入載體DNA，也就是質體或病毒DNA進入宿主細胞或微生物。一旦外來DNA進入宿主生物，就叫做重組生物。

3、限制酶（retriction enzyme）或核酸內切酶（endonuclease）可以在DNA特定的位置切成四個鹼基或小片的DNA。他們作為分子的剪刀。越長的鹼基分割片段，越不易切成DNA片段。DNA特定的限制位為回文序列，在兩端都可以觀察到。在位置1、2、3的鹼基會和同一列的6、5、4鹼基個別互補。限制酶是由細菌製造來保護自己以預防外來的DNA。他們藉由甲基化來保護他們的DNA與酵素的接合位。限制酶命名是以基因的第一個字母與物種的縮寫合併命名而成。物種是由主要英文字母命名，有時也有阿拉伯數字或羅馬數字。多數限制酶有粘性端（sticky end）會與另一個由相同限制酶切的相對應的DNA鹼基配

4、對，但有些無法辨認，例如：平頭端（blunt end）。當在適當的環境下，由相同限制酶切的DNA片段（annealed pieces），混合在一起會互補黏合。這些相黏片段會有斷續在他們當初所切的地方。實驗用DNA接合酶（DNA ligase）會在已經鹼基配對好的DNA片段形成磷酸酯鍵，製造出重組DNA。在基因複製步驟，對應於特定蛋白質的基因會和載體（cloning vector）結合這樣才可以轉移到宿主細胞。載體可以是質體（plasmid），也可以是嗜菌體（bacteriophage）。質體存在於細胞中，獨立於染色質，是可以自我複製、雙股的環狀DNA。質體可依尺寸、宿主專一性、複製數目來分類。

5、被作為複製的通常有抗抗生素活性可供辨識哪個細胞有質體，很大量時可以辨識重組DNA；而與限制酶重疊的DNA部位可以注入被多種酵素切割的DNA片段。質體進入宿主細胞的過程叫做轉型（transformation），是將DNA原封不動地融合並穿過細胞膜。質體通常由一個小寫字母p以及2到3個字母由研究者或實驗室命名，再加上對研究者有意義的數字。抵抗抗生素的基因在複製方面對質體是特別有用的，因為有質體承載（plasmid bearing）能力的器官。無成載質體（non plasmid bearing）的細胞會被抗生素殺死，只剩下具有質體的及有抵抗抗生素活性的蛋白。嗜菌體也可以當複製載體，且外來DNA也可以

6、以同功的步驟（analogous manner）插入病毒基因體。病毒DNA只能以傳染方式進入細胞而且會表現原本病毒的基因體。重組病毒基因體的複製體會被包入在感染過程中的複製的病毒，之後被感染的細菌就會被殺死，創造出斑狀（plaque）或在盤上對應於感染細胞的一點（spot），在斑上有許多感染病毒的複製體。有時候嗜菌體將基因轉到載體去感染細胞，但不會讓細胞進入溶解週期，而且DNA會在細菌細胞內穩定的表現。雜交（混種）探針（hybridization probe）是另一種基因工程方式。探針是一種與DNA互補的片段，並標誌著放射或是螢光染色體片段。當選定片段分離且再接合後，探針會與他的互補序列雜交。

7、探針會與接上互補DNA並藉由放射元素，染色質或螢光指出DNA的存在。探針可由寡核酸、較大的DNA片段或整個質體生成。他最少需要11個鹼基或在50個鹼基內80配對成功才可以與互補DNA穩定混種，但不同於溫度、濃度和配對位置錯誤的鹼基的影響。DNA可以來自複製DNA或DNA片段（DNA cuts）及分布在膠體電泳上的clonies。這個過程叫做南方點墨法。另一個相似作法用寡核酸偵測RNA片段是北方點墨法。特殊的蛋白質可以被互補抗生素偵測造成顏色反應稱為西方點墨法。這些對於辨認特定的DNA、RNA或蛋白質片段是很好的方式。回顧整個已知基因注入宿主的複製過程。被限制酶切割的注入（insert）基因與被

8、相同限制酶切割的質體DNA混合。接合酶（ligase）被用來黏著製造出一個完整的質體，其接下來轉型（transformed）進宿主。抗生素具有質體的宿主細胞的選擇性，這些帶有特定基因複製體的質體可以被注入基因的酵素，然後用西方點墨法偵測蛋白質或用互補DNA雜交探針偵測。一個或多個目標基因表現出目標蛋白質後，會被挑選並以發酵的方式大量生長。重組細胞會被溶蝕而目標蛋白會被純化利用。經過以上複製步驟，如何知道我們複製的目標基因，是如我們所預期的結果？答案在於我們對於基因與相對應蛋白質及作用細胞的了解程度。建立一個基因庫的計畫是最基本的，基因庫是重組生物的集合，而每一個都自然的含有我們所感興趣的染色體

9、DNA片段。基因庫是因限制酶用來切有機體的全部DNA而創造的，然後用先前提到的步驟把各種不同的片段接合到載體上，再把載體引入宿主有機體內。（對於複雜的有機體如人類，其它的方法被用來限制被繁殖到基因庫的DNA片段數量，一些其它的方法會在稍後描述。）每個寄主的菌落有可能有一不同的DNA片段，而整個染色體會被菌落的基因庫所呈現。因為施體染色體會被切成幾千個片段，篩選含有我們所需基因的菌落的方法是重要的。如果基因的序列是知道的，雜交探針就能被合成，然後被用來辨認有需要的基因的菌落。同樣的，如果蛋白質序列知道了，對應的寡核甘酸探針（oligonucleotide probe）能透過密碼（codon）的最

10、佳猜測（guessmer）或寡核甘酸對應到退化的密碼被合成。有時候，一個是靠寄主內表現的基因，另一個靠蛋白質經由它在寄主細胞的特色或蛋白質的抗體偵測所辨認。很多基因對於其它有機體類似的基因有同種性（相似性），而我們想要的菌落能用同種性基因序列當作探針來檢測。像之前提到的，對於人類基因，染色體太大而難以創造基因庫，也很難用之前描述的方法來篩選它。並且，真核生物有染色體上的基因作為一系列的外顯子和內顯子（插入序列），所以傳訊RNA（mRNA）一定要在蛋白質合成能發生前被剪接。大腸桿菌和其他原核生物的宿主有機體沒有剪接DNA，所以在大腸桿菌複製的DNA一定已經有插入序列的去除。就像圖2-4所說明的，

11、一個對所需人類蛋白質編碼的複製和表現DNA的典型方法會牽涉到從表現所選擇蛋白質的人類細胞分離mRNA，特別是在大量（如:胰島瘤被拿來獲取人類胰島素的mRNA）。mRNA會被一個叫做反轉錄酶來處理，而反轉錄酶會執行轉錄的逆作用 - 也就是它合成DNA股互補到mRNA上（互補的DNA叫做cDNA）。cDNA片斷能被接合一個載體上來創造一個基因庫並被用來篩選，就像之前所提到的同樣的方法。最近幾年有另外一個方法在發展，是一個技術叫做PCR就是聚合酶鏈反應。PCR是體外的步驟牽涉到特地定基因序列的放大。它需要我們想要放大的基因序列的知識，因為這過程牽涉到短寡核甘酸引子的使用。引子是互補到所要的基因上。無

12、論如何，這些引子的序列能成為最佳的密碼推測用法，對應於蛋白質序列或是從同種基因到其他種。基本的過程可在圖2-5看到，有三個步驟:變性，復性和伸展。含有我們有興趣基因的DNA股被高溫分開（如90到95），然後再混合一對引子，這對引子是對應到所需基因序列一小部分的部分已合成DNA，每個引子接在每股上。當溫度降低時，引子回復到目標DNA上。接下來一個對熱穩定的DNA聚合酶的加入（對熱不敏感的細菌）和足夠的去氧核糖核酸，溫度到75度而子序列繼續被引子加長。當循環重複個2330次時，兩個引子的中間序列被明顯放大，產生了幾百萬個複製品。被放大的DNA可以被隔離存放或是放置微生物中存放以便於做宿主轉移或表現

13、使用。這些方法對人類的基因是沒有用的，人類的DNA需要放到大腸桿菌中去表現。PCR這個技術對感染或是基因遺傳疾病的診斷或是普通疾病的診斷非常重要，例如膀胱纖維化疾病，因為可以偵測到很精確的基因序列。製造重組的蛋白質或胺基酸一旦基因被分離、複製、訂序後，一定要被例如細菌、真菌或是人類細胞培養等適合表現真菌類的東西所表現。一個表現系統包括特殊寄主器官的載體，可以輕易操作並可以自行分泌很多的蛋白質。對一個表現器官的選擇來說，需要考慮到很多因素。包括蛋白質的結構和一些經濟因素。細菌系統，例如大腸桿菌，一般都很便宜，但是不會總是產生有活性的蛋白質。如果期望的蛋白質可已以越少的價錢生產出來，越有利。對產物

14、的評估或是大規模的得到蛋白質的評估對於商業應用是很重要的。每個步驟都伴隨著精細的分析步驟來確定是否為正確的蛋白質。其中一個對組織的選擇的重要因素是此蛋白質必須被醣化使它有活性。真核細胞的蛋白質是經過高基氏體和內質網後被醣化然後送到細胞膜上。氮的醣化作用發生在Asp的殘基，例如Asn-X-Ser.或是Asn-X-Thr.或是氧的醣化發生在Ser或Thr上。寡醣結合在Asp的殘基上是非常複雜的，包括蛋白質寡醣的內質網修飾。中心寡醣被修飾後，和一個新的醣的殘基在高基氏體鍵結到protein上。各種單糖單元包含在最終的寡糖結構中，那些特殊結構是蛋白質和有幾體。醣化對哺乳動物的醣蛋白重量增加有相當多地貢獻。在生藥學上一個相當重要的結構特色就是寡糖的終端殘基有時就是唾液酸殘基。唾液酸就是在N上乙醯化的神經氨酸，它提供了一個像是蓋子的東西以防蛋白接上肝臟細胞膜上的受體去移除血流中的未唾液化蛋白。唾液化蛋白在人體中的半衰期比那些沒有唾液酸的蛋白質還要長很多。到目前為止，醣化所扮演的角色還不是那麼的清楚，當一些醣蛋白以不是醣化的形式時無法接在它們的受體上或是無法引起適當的反應，其