抗体纯化大全.docx

1、抗体纯化大全抗体的纯化第一节 硫酸铵沉淀法基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。试剂及仪器 组织培养上清液、血清样品或腹水等 硫酸铵（NH4）SO4 饱和硫酸铵溶液（SAS） 蒸馏水 PBS(含0.2g/L叠氮钠)

2、 (见附录一) 透析袋 超速离心机 pH计 磁力搅拌器实验步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%50%。一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS）将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25C）；其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；二、沉淀1、样品（如腹水）20 000g 离心30 min，除去细胞碎片；2、保留上清液并测量体积；3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（

3、v/v）；4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4C），使蛋白质充分沉淀。三、透析1、蛋白质溶液10 000g 离心30 min（4C）。弃上清保留沉淀；2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。应用提示一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)；2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时 或过夜（4C）；3、3000g

4、离心30 min（4C），保留上清液；4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的；二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）；三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。参考文献1、 Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies

5、 from murine ascites using a DEAE disk. Hybridoma 12, 135.2、 T.G.库珀着，徐晓利主译生物化学工具 人民卫生出版社出版（1980），353。（夏泉）表1.室温下硫酸氨饱和度由起始浓度（S1）提高到终浓度（S2）时需加硫酸氨的量（g/L）0%10%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%90%56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 76757 86 118 137 150 183 216 251 288 3

6、26 365 406 449 494 592 64929 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 61930 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 58319 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 54612 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 52231 63 94 129 164 200 238 278 319 411 50631 63 97 132 168 205 245 285 375 4693

7、2 65 99 134 171 210 250 339 43133 66 101 137 176 214 302 39233 67 103 141 179 264 35334 69 105 143 227 31434 70 107 190 27535 72 153 23736 115 19877 15779第二节 DEAE离子交换层析法基本原理离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。DEAE是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过DEAE柱时，带负电荷的蛋白质可以被DEAE吸附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等

8、电点的缓冲液，此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEAE离子交换剂上，然后用增加盐浓度的方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱，也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。本文以腹水中mAb的纯化为例来介绍此方法。试剂及仪器 抗体样品（小鼠腹水或经硫酸氨沉淀的抗体） DEAE离子交换剂（阴离子交换剂） 层析柱（2.5cm 20 cm） 缓冲液 A：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +35 mmol /L NaCl 缓冲液 B：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +70mmol /L NaCl 缓冲液 C：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +500 mmo

9、l /L NaCl 缓冲液 D：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 PBS (见附录一) 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力搅拌器 蠕动泵和部分收集器 紫外检测仪 梯度发生器 电导仪 pH计 离心机实验步骤整个层析过程最好在4C 进行,可在冷室操作；1、抗体样品对缓冲液B 透析过夜（4C）；2、按说明处理DEAE离子交换剂。然后用缓冲液A 平衡。用20倍体积缓冲液A洗交换剂，可用过滤或离心法反复洗到流出液的电导率等于缓冲液A；3、将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A 中，装入层析柱。4、用等体积的缓冲液D 稀释透析过的抗体样品，使之与缓冲液A 的离子强度一致；5、稀

10、释后的样品10 000g 离心10 min（4C），除去沉淀变性的蛋白质；6、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接；7、抗体样品以1ml/min 流速上柱，然后用缓冲液A 洗柱1ml/min，将未吸附的蛋白质洗出。直到流出液在280 nm 的吸光度小于0.05；8、吸附的蛋白质，用连续增加NaCl的浓度来洗脱。用线性梯度缓冲液（35-500 mmol/L NaCl）或分段缓冲液（35、70、140、280、500 mmol/L NaCl）洗脱。流速1ml/min ，分部收集洗脱液 2ml / 管 （图2-4-1）；9、椐紫外检测结果，将抗体峰部分合并。装入透析袋对PBS(含0.2g/L叠

11、氮钠)4C 透析或冷冻（视抗体的稳定性而定）；10、 DEAE离子交换剂可按照商品说明再生使用。图2-4-1 DEAE离子交换柱层析纯化小鼠IgG流速：1ml/min 样品：0.5ml腹水检测方法1、大部分小鼠的单克隆抗体IgG可在50200mmol/L NaCl浓度之间洗脱。2、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法（RIA、ELISA）检测各部分洗脱液的抗体存在及效价。实验要点及说明1、要得到满意的分离结果，每ml DEAE 离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过10mg。2、用经硫酸铵沉淀初步纯化的抗体代替小鼠腹水作为样品，可得到更好的纯化结果。3、如抗体与DEAE离子交换剂不能有效的

12、结合，可将起始缓冲液的pH提高0.1个单位,直到可以有效结合为止。4、如果没有合用的蠕动泵和部分收集器，可用手工上样和收集。洗脱液每管收集0.5-2ml ,然后用分光光度计测定各管280nm波长的吸光度值。5、该方法可按比例扩大。用适合于高流速的大柱和相应的交换剂来纯化大量的蛋白质样品。参考文献1. Corthier, G., Boschetti, E. and Charley-Poulain, J. (1984) Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatog

13、raphy J. Immunol. Meth . 66, 75-79.2、张保真编译西安医科大学出版（1986）免疫组织化学理论与技术 69-71。（夏泉）第三节 羟磷灰石层析纯化抗体基本原理羟磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2吸附蛋白质的机理，通常认为与其晶体表面的Ca2+ 和PO43- 两种基团相关。因为带电基团紧密排列于晶体表面，可能通过偶极子之间的相互作用来吸附蛋白质。样品被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液（较高浓度的盐溶液）冲洗，可使之解析。解析下来的物质在流经层析柱的过程中向前移动，遇到前面新的吸附剂可再被吸附。在反复的吸附解析再吸附再解析的过程中，由于待分离物质与吸附剂之间的吸附能

14、力不同，它们沿洗脱液流动方向移动的速度也不相同，所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而被分离。抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。试剂及仪器 抗体样品（腹水或培养上清液） 羟磷灰石（Hydroxylapatite 有售） 层析柱（2.5cm 20 cm） 吸附缓冲液：20mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl 洗脱缓冲液：500mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl PBS (见附录1) 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力搅拌器 蠕动泵和部分收集器 紫外检测仪 梯度发生器 离心机实验步骤1、羟磷灰石柱的准备：将羟磷灰石悬浮于吸附缓冲液中，使之充分水合后装柱。用10 柱体积的吸附缓冲液洗柱；2、样品的预处理：含抗体的样品先在4C对吸附缓冲液透析过夜或