细胞免疫荧光染色的自我总结资料下载.pdf

1、也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致（中杉金桥中杉金桥 封闭用正常羊血清工作液封闭用正常羊血清工作液 ZLI9022）ZLI9022）5、二抗（中杉金桥（中杉金桥 594594 标记山羊抗兔标记山羊抗兔 IgG ZF0616IgG ZF0616）（中杉金桥（中杉金桥 488488 标记山羊抗小鼠标记山羊抗小鼠 IgG ZF0512IgG ZF0512）细胞爬片的免疫荧光染色步骤：细胞爬片的免疫荧光染色步骤：1）实验前一天，将细胞接入铺有 2222mm（或 2424mm）盖玻片悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片的六孔板或十二孔板中。2）第二天，待细胞汇合度达到 70左右开

2、始进行染色步骤。3）用新鲜配制 4多聚甲醛4固定细胞 10 分钟。4）PBS 洗三遍，每次 5 分钟。5）用 0.1 triton X-100PBS 配制对细胞透化处理 10 分钟。6）加 PBS，使液面覆盖玻片。如果细胞贴壁好，PBS 洗时可轻摇孔板洗三遍，每次 5 分钟不必一直摇。如果细胞贴壁不好就不必了，可以考虑多加点 PBS，或者每次浸泡时间稍延长 1-2 分钟。7）2二抗同源血清购买的纯的羊或牛血清用 PBS 稀释至 2%，当前用的是羊血清封闭 30 分钟-60 分钟，PBS 简单冲洗两遍或者不洗。8）染色前根据公司说明书建议的浓度配好 1 抗（1 抗稀释液购自中杉金桥）建议先测试抗

3、体浓度，可依据公司推荐的浓度增加和减低浓度进行测试；如公司推荐 1：200，可将抗体配成 1：50、1：100、1：200、1：400、1：600，以不同浓度进行孵育，如果抗体有效，应当在有效染色的抗体浓度范围内都可染色，只是颜色深浅不同，加入 1抗，4冰箱孵育，一般要大于 18 小时有的抗体可能需要多达 50 小时。孵育过程中注间保持容器湿度，切勿干片！。9）PBS 洗三遍，每次 5 分钟。10）避光！加入 PBS 配制的二抗，室温孵育 30-45 分钟似乎室温高一点二抗结合得更好，实际操作过程中应考虑将室温控制在 20-35。11）避光！PBS 洗四遍，每次 5 分钟。12）避光！加入 0

4、.5 ug/ml DAPIPBS 配制当前也有已经配好的 DAPI，如碧云天公司的，直接用染色 10 分钟，染完后用微量进样器将玻片上附着的残余 DAPI 尽可能小心吸干净。13）避光！用 PBS 洗一次 5 分钟或简单洗三遍，去除多余的 DAPI，洗完后玻片上附有少量 PBS，不必吸掉，因为玻片不宜太干燥。14）避光！加入 20L-50L 封片剂（购自碧云天公司）封片封闭液 PH8.5，封片剂多少根据玻片大小决定，原则上要让玻片贴在载玻片上，但不应该滑动。15）将封片好的细胞样品保存在湿盒中，盒中放置湿的滤纸，可于 4 度冰箱中存放 2 周以上。注意：1、玻片与载玻片的处理:泡酸去污,冲洗,晾干,75%酒精杀菌，泡纯酒精脱脂,蒸馏水洗（此时用镊子夹着洗）,晾干备用。2、封闭液若使用的是 100%的纯牛或羊血清，使用前用 PBS 稀释至 2%，不与一抗同源即可。3、加入二抗时与加二抗后的步骤全部避光操作！尽可能减少荧光的淬灭。4、PBS 应当过滤，减少残渣。