基于生物质谱的蛋白质组学绝对定量方法研究进展资料下载.pdf

1、北京市科委重大项目（H030230280190）资助作者简介:曹?冬（1980）,男（汉族）,河北唐山人,博士研究生,从事蛋白质组学研究。E?mail:cao.dong1980 通信作者:钱小红（1953）,女（汉族）,江苏人,研究员,从事蛋白质组学研究。qianxh 第 29 卷 第 3 期2008 年 5 月质 谱 学 报Journal of Chinese Mass Spectrometry SocietyVol.29?No.3May 2008基于生物质谱的蛋白质组学绝对定量方法研究进展曹?冬,张养军,钱小红（军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京蛋白质组研究中心,北京?102206）

2、摘要:蛋白质组学定量方法包括相对定量和绝对定量两部分。相对定量蛋白质组学（也称比较蛋白质组学）是指对不同生理病理状态下细胞、组织或体液蛋白质表达量的相对变化进行比较分析;绝对定量蛋白质组学是测定细胞、组织或体液蛋白质组中每种蛋白质的绝对量或浓度。目前蛋白质组学的绝对定量方法主要有基于内标法的蛋白质组学绝对定量方法和基于质谱数据统计分析的非标记方法。蛋白质组学定量的信息可以帮助了解蛋白质在相互作用网络中所起的作用;通过对临床生物标记物绝对量的分析,可以帮助直观地判断疾病的发生和发展过程,这对于临床诊断和疾病治疗都具有现实的指导意义。关键词:定量蛋白质组;绝对定量;同位素标记法;非标记定量法;生物

3、质谱中图分类号:O 657.63;Q 1?文献标识码:A?文章编号:1004?2997（2008）03?185?07Development of Absolute Quantification ofProteomics Based on Bio?Mass SpectrumCAO Dong,ZHANG Yang?jun,QIAN Xiao?hong（Beij ing I nstitute of Radiation Medicine,Beij ing Proteome Research Center,Beij ing 102206）Abstract:T he quantitative method

4、s of proteomics include the relative quantitation and abso?lute quantitation of proteins.Relative quantitation of proteomics is the analysis of the rela?tive changes of the expressed proteins in the samples originated from different physiologicaland pathological situations.The absolute quantitation

5、of proteomics is to determine the ab?solute amount or concentration of each protein in a biological sample,such as cells,tissue orbody fluid.Currently,the main strategies of absolute quantitation of proteomics are com?posed of the quantitative methods based on internal standard strategy and the labe

6、l?freetechnique with the statistic analysis of MS data.T he quantitative information of the pro?teome can help us understand the biological function of proteins in the interaction network.With the determination of the absolute quantitation of the biomarker,we can directly judgethe status of a diseas

7、e,which will benefit the clinical diagnosis and the treatment of the dis?ease.Key words:quantitative proteomics;absolute quantitation;isotopic labeled method;label?free quantitation;bio?mass spectrum?人类基因组计划的完成,必然促使科学家对其功能（即功能基因组）进行研究 1?2。由于仅仅从基因组学的角度无法完全正确预测基因转录过程中发生的剪切、拼接以及在翻译时开放阅读框架密码子的起始、终止位置和翻译

8、后的各种修饰情况,科学家们先后启动了以不同研究对象为目标的蛋白质组研究计划,如人类血浆蛋白质组研究计划、人类肝脏蛋白质组研究计划、人脑蛋白质组研究计划等,以解决与人类健康密切相关的基础科学问题和实践问题。自从 20 世纪 90年代蛋白质组名词首次出现以来 3,经过 10 多年的发展,蛋白质组学的研究已经取得了巨大的进展。蛋白质组学的技术进步主要包括:不同机理和模式的分离技术（如各种电泳技术、色谱技术）的有效组合 4?5,以获得对蛋白质或多肽混合物的高效分离;不同离子源、不同类型质量分析器的优化组合以及与多维、多模式分离技术的联用 6?7,为分离分析复杂生物体系中蛋白质混合物奠定了基础;另外越来

9、越多的生物物种基因组测序工作的完成和生物信息学工具的发展,为规模化、通量化进行蛋白质组的鉴定和数据分析提供了保障。随着蛋白质组研究的不断深入,蛋白质组学研究中仅能提供蛋白质种类和修饰信息的定性分析技术已经不能满足目前研究工作的需要,因此,定量蛋白质组学技术和方法的研究正逐渐成为领域方法学研究的热点。蛋白质组学定量方法分为相对定量和绝对定量两部分:相对定量蛋白质组学（也称比较蛋白质组学）是指对不同生理病理状态下,细胞、组织或体液蛋白质表达量进行的相对比较分析,如基于二维凝胶电泳（2?DE）技术直接对处于不同状态下蛋白质表达变化的比较分析 8、荧光胶内差示电泳技术（differential in?

10、gel electrophoresis,DIGE）9以及基于同位素亲和标签（isotope coded affinitytags,ICAT）与质谱分析结合的相对定量技术 10?11、等量标签相对定量方法（isobaric tagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ）12和金属元素络合物标签结合质谱相对定量方法 13等;绝对定量蛋白质组学是测定蛋白质组中每种蛋白质的绝对量或浓度。在有机体中,蛋白质的相互作用是非常复杂的,在真核生物蛋白质组中,每 4 个蛋白质中就有一个蛋白质可能参与多个不同的蛋白复合物的组成。由于不能确定一个蛋白是否代表一个复合物的化

11、学计量核心（stoichiometric?core?）,而使此蛋白在相互作用网络中的功能难以捉摸,尽管有一些全功能蛋白已经通过免疫亲和的方法得到分离,但还不能确定它们是否具有严格的化学计量,所以为了充分了解蛋白质在相互作用网络中的功能,就必须用量的信息来表征蛋白质 14。绝对定量对于临床疾病的诊断和治疗具有明显的现实意义 15,蛋白质生物标记物量的变化,可以直接反映疾病的发展状况,因此,通过对疾病不同时期生物标记物绝对量的监测,可以直观地判断疾病的发展情况,制定相应的治疗措施。由于蛋白质绝对量在蛋白质相互作用及临床上具有重要意义,所以,相关的方法学研究备受关注,并取得了一定的进展,本工作主要对

12、此方法进行评述。1?基于内标法的蛋白质绝对定量1.1?同位素标记的肽段作为内标的蛋白质组绝对定量基于同位素标记的肽段作为内标的蛋白质绝对定量的基本策略是:在被定量蛋白质的氨基酸序列中选择一段相对分子质量大小适中（一般为 0.9 2 ku）、质谱信号响应较强的肽段作为模板,用化学合成或细胞培养的方法合成带有一定同位素（如13C、15N、2H）标记的相同肽段（仅相对分子分量有差异）作为内标,通过检测肽段的质谱信号强度之比（峰高或峰面积比）来对相应蛋白质进行绝对定量。应用内标法的前提条件是:1）被绝对定量的蛋白质酶切要充分;2）被选择作为内标肽段模板的肽段和蛋白质间存在一定的定量关系。Gerber

13、等 16用化学合成的方法合成了同位素标记亮氨酸的肽段作为待测蛋白质的内标,应用选择反应监测（SRM）质谱法对细胞溶菌产物中提取的蛋白质及相应的磷酸化蛋白进行绝对定量研究。为了评价该方法的可行性,他们将已知浓度系列的标准肌红蛋白加入酵母细胞溶菌产物中,在此背景下,以肌红蛋白的某段肽段（LFT GHPETLEK 和 ALELFR）为模板,化学合成同位素标记的相应肽段（LFT GHPETL*186质 谱 学 报?第 29 卷?EK 和 ALEL*FR,其中 L*代表亮氨酸被同位素标记）作为内标,应用 SRM 质谱法检测肌红蛋白的绝对量,并与已知加入的量进行对比。Beynon 等 17采用人工基因表达

14、合成特定蛋白质的方法对 20 种鸡骨骼肌蛋白质进行绝对定量,其基本策略是:首先找到每种待定量蛋白质的标签肽段（Q?肽段）,然后找到相应的表达这些标签肽段的基因片断,用人工方法将这些基因片断转载到大肠杆菌中进行复制和表达,所得到的蛋白质（QCAT?蛋白质）中包含了上述的所有标签肽段,同时这些肽段的所有氮元素被相应的15N 同 位 素替 换（在蛋 白表 达 介 质中 以15NH4Cl作为唯一氮源）;将已知量的 QCAT?蛋白质与待测蛋白样品进行混合,胰酶酶切后,进行质谱分析,被15N 标记的Q?肽段和相应的未被标记的 Q?肽段在质谱上被区分开来,根据各自的质谱信号强度和 QCAT?蛋白已知加入量可

15、以绝对定量样品中的待测蛋白质。但此方法存在的局限性有:1）所选肽段相对分子质量要在1 000 2 000 以内（以保证在质谱上有较强的信号响应）,不能含半胱氨酸（防止 QCAT?蛋白形成复杂的分子内或分子间的二硫键）,且在整个QCAT?蛋白中每个肽段都是唯一的;2）QCAT?蛋白质相对分子质量不能太大,如果超过 150ku,QCAT?蛋白的合成将比较困难。除了上述方法外,Havlis 等 18应用18O 标记的肽段作为内标,比较了在溶液中和经胶上酶切两种方法处理的蛋白质绝对定量的可行性。结果表明,在溶液中18O 标记的绝对定量方法是精确的。经胶上酶切分离后,蛋白质的绝对定量会出现较大误差,其主

16、要原因是选择作为内标的肽段胶上回收率很低;另一种原因是不同的肽段在胶上的回收率也是不同的。Mayya 等 19应用同位素标记和液相色谱选择反应检测（LC?SRM）技术对细胞周期转化和凋亡过程中的 4 个磷酸化调节蛋白进行绝对定量分析,以研究蛋白质的磷酸化作用对细胞周期转化和凋亡的调节作用。1.2?同位素标记的氨基酸作为内标的蛋白质组绝对定量此方法的策略是:将待测定的蛋白质在强酸条件下,进行完全的水解,全部形成氨基酸混合物,然后加入已知量的同位素标记的氨基酸作为内标,经 MALDI?T OF?MS 质谱检测一对氨基酸的质谱峰强度以实现对氨基酸的浓度测定,再根据此氨基酸在蛋白中的含量,计算出蛋白的量。Mirgorodskaya 等 20采用酸水解法将已知序