人乳腺癌PDX模型的研究进展资料下载.pdf

1、695 704 SCIENTIA SINICA Vitae 引用格式:马丽君,战军,张宏权.人乳腺癌 PDX 模型的研究进展.中国科学:生命科学,2016,46:695704 Ma L J,Zhan J,Zhang Y Q.Recent progress in patient-derived tumor xenograft model of breast cancer.Sci Sin Vitae,2016,46:695704,doi:10.1360/N052015-00386 2016中国科学杂志社 中国科学杂志社SCIENCE CHINA PRESS评 述 人乳腺癌 PDX 模型的研究进展

2、马丽君,战军,张宏权*北京大学基础医学院分子细胞生物学与肿瘤生物学实验室,北京 100191*联系人,E-mail: 收稿日期:2016-02-18;接受日期:2016-03-03;网络版发表日期:2016-04-14 国家自然科学基金（批准号:81301802,81230051,31170711）、教育部高等学校学科创新引智计划和北京市重点学科基础医学学科建设项目（批准号:BMU20110254）资助 摘要 乳腺癌病人来源的异种移植物（patient derived xenografts,PDX）不仅能忠实地保留患者肿瘤的分子表型和基因型变化,而且能够再现原发肿瘤的异质性,因此被应用于肿瘤耐

3、药机制和抗肿瘤药物筛选的研究.该模型保持了患者肿瘤基因表达模式、突变状态、药物反应和肿瘤结构等生物学特性,在临床肿瘤治疗转化医学研究中具有不可替代的作用.PDX 作为一个新的临床前评价肿瘤药物敏感性的工具越来越受关注.本文总结了乳腺癌 PDX模型的发展历史,阐述了异种移植过程中病人细胞和动物的准备,以及该模型在抗肿瘤药物研发中的优点和局限性.总之,乳腺癌 PDX 模型研究已初见成效,但在其成功率、时效性和成本控制等方面还有待进一步优化.关键词 乳腺癌,病人来源异种移植物,动物模型,肿瘤干细胞 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率呈迅速上升趋势,在女性各类肿瘤中居首位,5 年患病率高

4、达 156/10 万1.尽管主要的筛查和治疗手段都在进步,转移性乳腺癌仍是无法治愈的.大多数病人因原发或获得性药物抵抗最终死于乳腺癌的转移和耐药.近些年,随着干细胞理论研究的不断深入,越来越多的证据表明肿瘤中存在一小群肿瘤干细胞（cancer stem cell）,它们具有自我更新及形成各种不同谱系肿瘤细胞的能力,它们是导致肿瘤产生以及肿瘤复发和转移的根源.因此,针对肿瘤干细胞而研制出有效的药物,才有望从根本上战胜癌症.目前,乳腺癌干细胞异种移植的动物模型已建立,但是这种模型还处于初级阶段,有些肿瘤干细胞的成瘤率还不尽人意,并且近些年的研究也仅局限于乳腺原位接种成瘤.因此,如何能模拟出与人乳腺

5、癌发病机制相似的动物模型是亟待解决的问题,以通过有价值的动物模型来寻求更好的治疗策略.体内临床前动物模型在癌症新疗法中有重要的用途,是评估抗肿瘤药物临床前疗效和预测药物毒性的有效工具2,3.然而不同于结肠癌和胰腺癌等其他癌种,乳腺癌异种移植模型尤其难建立.在过去的50 年里,大部分临床前知识是基于研究细胞系的异种移植模型,如将乳腺癌细胞皮下注射获得.这些模马丽君等:人乳腺癌 PDX 模型的研究进展 696 型遗传学背景清楚并能进行基因敲除、转基因等技术操作,但是他们不能预测由于细胞系产生的遗传变异和肿瘤异质性,从而导致不能准确判断药物在临床试验中的作用47,因此需要重新创建复杂的原发乳腺癌模型

6、来克服这个问题.病人来源异种移植物（patient-derived xenografts,PDX）模型是将手术中获得的新鲜乳腺肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠（Mus musculus）（图 1）,用于药物开发和预测针对病人个体化治疗的靶向制剂2.通过基因诊断技术将 PDX 模型和病人来源的肿瘤之间进行复杂多重比较,证实在基因拷贝数、基因突变和表达模式等方面二者具有高度一致性.分子指纹的保留和对癌症治疗的预测价值重新燃起人们对 PDX 研究的信心.近年来,有关乳腺癌 PDX 模型研究报道的数量呈指数增加.本文概述乳腺癌 PDX 最显著的特征,总结研发乳腺癌药物模型的最新进展.1 实验动物的选择 1.

7、1 裸鼠 裸鼠无胸腺,缺乏成熟 T 细胞,不产生细胞毒效应细胞;B 淋巴细胞功能较低,免疫球蛋白主要是免疫球蛋白 M（immunoglobulin M,IgM）,只含少量免疫球蛋白 G（immunoglobulin G,IgG）.因而裸鼠免疫力低下,移植排斥少.移植到裸鼠体内的肿瘤仍能保持对激素的依赖性,因而可以用裸鼠来制作激素依赖性肿瘤模型.裸鼠体内的自然杀伤（natural killer,NK）细胞,脾脏和淋巴结中含有巨噬细胞和抗原递呈 细胞,以及 B 细胞和免疫球蛋白,有一定的排斥移植物的作用.1951 年,Toolan8首次在免疫缺陷啮齿动物成功移植了人类肿瘤,他在辐照或可的松治疗大鼠

8、（Rattus norvegicus）中获得人类表皮样癌.1966 年,Flanagan9发现裸鼠，激发了人们研究移植瘤的实验兴趣,到 1969 年,Rygaard和 Povlsen10报道人类肿瘤可在裸鼠中连续生长.10 年后,伦敦的 Bailey 小 组11,12第一个发表大系列人类乳腺癌移植裸鼠模型.这个小组首次报道移植瘤的组织学特征、移植的可行性和较低的抑制率.尽管这一模型存在明显的潜在价值,但与细胞系模型比较,因其繁琐的方法和昂贵的成本在用于评价药物疗效时受到限制.1.2 SCID 小鼠 重度联合免疫缺陷（severe combined immuno-deficiency,SCID）

9、小鼠是由于第 16 号染色体上的隐性突变基因发生突变而产生的.SCID 突变基因属于缺陷的 DNA 修复基因,影响双链断裂后的修复能力.纯合的SCID小鼠几乎完全丧失T,B淋巴细胞免疫功能.所以 SCID 小鼠肿瘤移植存活率要高于裸鼠.SCID 模型中恶性肿瘤不但转移率高,而且能广泛扩散,与人体肿瘤生物学行为极为相似13.SCID 小鼠是继裸鼠之后,人类发现的又一种十分有价值的免疫缺陷小鼠.目前,SCID 小鼠多用于同种肿瘤移植模型.从总体上讲,人源性乳腺癌细胞株移植到裸鼠和 SCID 小鼠骨上的成功率还是较低的,这是因为转移也有其种属特异性,人源性的癌细胞浸润和生长 乳腺癌病人小鼠 Swis

10、s nude SCID NOD/SCID NSG外科手术112个月原代补充雌二醇：微球或饮用水第2代PDX的建立分子生物学特征药物筛选移植部位：肩胛间的脂肪垫 乳腺脂肪垫 侧腹部第1代16个月 图图 1 乳腺癌病人异种移植物的建立乳腺癌病人异种移植物的建立（网络版彩图网络版彩图）中国科学:生命科学 2016 年 第 46 卷 第 6 期 697 需要人类组织微环境的支持1416.而且,移植异种组织时,受体内 NK 细胞、巨噬细胞等仍会或多或少对其产生免疫反应.所以,为了提高转移的发生率,更真实地模拟出人类乳腺癌的转移过程,人们开始考虑将人源性骨移植到小鼠体内,这同时也对小鼠的免疫力提出了更高的

11、要求.1.3 NOD/SCID 小鼠 将 SCID 小鼠与 NOD（non-obese diabetic）小鼠杂交后可以得到一种新的 NOD/SCID 小鼠,NOD/SCID小鼠既有由于 DNA 修补基因缺陷而导致的 T,B 细胞发育缺陷,又有 NOD 小鼠所具有的 NK 细胞活性下降、补体活性下降和巨噬细胞功能缺陷.而且NOD/SCID小鼠的生殖系统和性激素分泌正常,可以用来研究性激素依赖性肿瘤1722.Landis 等人23发表了一篇全面的乳腺癌 PDX 模型综述,详细比较不同成瘤方法.乳腺癌模型成瘤率（10%20%）取决于肿瘤的级别、亚型（三阴性乳腺癌高于腔型乳腺癌和人类表皮生长因子受体

12、 2HER2+阳性的肿瘤）和位置（腹水、胸腔积液和转移的成瘤率高于原发性乳腺癌）23,2427.受体小鼠的选择似乎没有什么影响,成瘤率已证明在重度联合免疫缺陷小鼠中是相似的,如非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠（NOD/SCID）和非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷/缺失白介素 2受体（NOD/SCID/interleukin 2 gamma-receptor-null,NSG）小鼠23,26.外科切除肿瘤的大小和质量是很重要的参数28.坏死区域应该被移除,肿瘤块应在无菌条件下和极短时间内移植.乳腺癌PDX 成功率的潜在主要制约因素之一是病人肿瘤雌激素受体的表达.Bailey 等人11提出,病人的

13、激素水平不同可能是雌激素受体阳性乳腺癌成瘤率低的原因,但仍然难以建立一个高雌激素受体的乳腺癌移植瘤模型.这表明,除了体内循环雌激素水平外,也与病人的其他因素如乳腺癌细胞增殖,或者与不干涉其他的可移植性肿瘤有关（如结直肠或胰腺肿瘤）.有趣的是,Du Manoir 等人29研究发现,小鼠移植瘤与病人乳腺肿瘤的生物学特性相关,移植瘤的基因芯片分析显示出调控预后的基因变化明显,如伤口愈合、增殖和血管生成相关基因.其他基于啮齿动物和人类之间的生理差异也一直在探索.Rui 等 人30通过 NSG 小鼠与转基因小鼠杂交产生表达生理水平人催乳素鼠,提高了雌激素受体阳性乳腺癌的成瘤率.Beckhove 等人31

14、将 NOD/SCID 小鼠分成两组,一组在进行骨移植前对其进行外照射处理,另一组在骨移植前不进行任何处理,研究发现在两组中,人源性乳腺癌细胞株都能正常生长且乳腺癌细胞 的组织形态和肿瘤标记物的表达均未发生改变.有报道27,32,33将成人骨移植到 NOD/SCID 小鼠后,破骨细胞、成骨细胞功能正常,移植骨内部出现了人源性骨血管的生长,骨四周则有大量能为成人骨提供营养的小鼠源性血管的生长,并且人骨中的 B 细胞能在小鼠体内正常存活、成熟、归巢和产生 IgG.由此可见成人骨移植到小鼠体内后不仅可以存活,而且可以保持原来的形态和功能,所以将人源性骨移植到小鼠体内是可行的.另一种方法是注射肿瘤起始细

15、胞到免疫缺陷小鼠.事实上,尽管大多数 PDX 是通过体外不经任何操作移植肿瘤块获得,而一小部分移植瘤是通过注射细胞悬液获得,这些细胞通过特异肿瘤细胞表面标记被分选获得.Al-Hajj 等人34就是利用这个方法从乳腺肿瘤标本和胸腔积液中分选获得 CD44+/CD24/LowLinneage乳腺肿瘤干细胞注射 NOD-SCID 小鼠.最近研究发现,乙醛脱氢酶 1（acetaldehyde dehy-drogenase,ALDH1）阳性癌细胞移植到人源化 NSG 小鼠乳腺脂肪垫可得到乳腺癌 PDX 模型35.1.4 NOG 小鼠 NOG 小 鼠 由 日 本 实 验 动 物 研 究 所（Central

16、 Institute for Experimental Animals,CIEA）的 Mamoru Ito 培 育 而 成.Ito 博 士 领 导 的 小 组 通 过 杂 交NOD/SCID小鼠和-链IL-2受体敲除小鼠成功建立了一 个 免 疫 功 能 严 重 不 全 的 小 鼠 品 系,称 之 为NOG（NOD/Shi-scid,IL-2Rnull）小鼠.NOG 小鼠缺乏T 细胞、B 细胞和 NK 细胞,树突状细胞和巨噬细胞功能减退;缺乏补体活性,淋巴瘤的发病率非常低;不会随年龄增长产生 T,B细胞泄漏;寿命长,对辐射敏感,对微生物病原菌敏感.与 NOD/SCID 小鼠相比,NOG 小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高,同时能够植入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织.另外,NOG 小鼠还能满足作为人类免疫系统模型的需求,植入人类造血干细胞后,NOG 小鼠的外周淋巴组织可以产生人类 T 细胞.可应用于人类造血系统和免疫系统模型、马丽君等:人乳腺癌 PDX 模型的研究进展 698 人类肝脏模型、人类传染病模型、移植物抗宿主病模