基因工程笔记总结Word下载.docx

1、-OH的单链延伸末 端。b: 加入dATP/dTTPTP2、A与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的PPi。 3-OH末端将会出现单纯并释放出焦磷酸 由poly（dA）3、AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。和poly（dT）组成的DNA单链延伸。c: 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。4、AMP 腺苷酸”复合物。上，形成“一条链的5端PDNA- 缺点：当poly（dA），Poly（dT）不严格等长时、 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，,重组DNA分子会5有缺口

2、。 AMP释放出需要用：只连“LigaseDNA聚合酶I填补，然后用DNA，不连“Nick切口”Gap缺口”连接酶连接 最后的缺口。4. 平末端连接 连接酶 . 四两种DNA 1. E. Coli DNA ligase-衔接物连接法与接头连接法 （1） 平末端的衔接物连接法 来源：E.coli 衔接物的5适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连末端和待克隆的DNA片段的5 -末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过平末端） T4 DNA连接 2. T4 ligase酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA 分子和克隆载体分子。 来源：T4 phage 及适用：粘性末端

3、 平末端 T4 vs. E.coli（2） 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶（BamHI）粘性末端的典型DNA价格便宜，T4 DNA ligase制备容易，能进行各种类型接头分子与平末端的DNA连接反应，应用更广泛！ 片段连接后，后者变成具有粘性末端的.Ligase五DNA分子。的反应温度 七最佳温度： .热稳定的DNA连接酶来自嗜热高温放线菌 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是热稳定的4-15DNA 比较合适。连接酶的应用：寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, 分子连接的四种形式DNA 六. OLA） 连接酶链式反应（ligati

4、on chain reaction, LCR4. 平末端加尾；3. 2. 粘性末端；1. 平末端；平末端） 或接头（linker）加衔接物（adaptor） （1）Digestion and Ligation 寡核苷酸连接测定法的作用粘性末端连接1 检测突变自我环化作用Problem: （ ）寡核苷酸连接测定法的作用：、双酶切（两种内切酶）解决方法：a、去磷酸b检测突变。 寡核苷酸连接测定法1. 平末端连接2.（1）原理: 末端补平 末端标记及随机引物标记两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶 cDNA第二链合成（见cDNA文库构建）DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在 分

5、子上的位置是彼此相邻的。靶DNA DNA测序 链是完全碱基配对时，便可以被连当他们同靶DNA三. T4 DNA接酶连接起来。 聚合酶 1. T4 DNA聚合酶特点结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两 活性：个探针之间不能形成磷酸二脂键。 5 3聚合 低 DNA Polymerase第五节 DNA聚合酶 3外切 无 常用的DNA聚合酶：外切 高！ 1、大肠杆菌聚合酶DNA2.T4 DNA聚合酶活性的条件Klenow、大肠杆菌2DNA聚合酶的大片段酶 模版、引物、原料dNTP 3. T4 DNA 聚合酶的“取代合成”T4 DNA3、聚合酶 法末端标记 4聚合酶、T7 DNA四. T7 D

6、NA5、反转录酶等。 1. T7 DNA聚合酶特点 一、大肠杆菌DNA聚合酶 聚合DNA聚合酶特点 高！ 低 3 活性：5 聚合 5有 外切3 5 外切 高 2. T7 DNA 外切 聚合酶的应用低 3 5 合成：高活性，几kb，不受DNA二级结构的影响 聚合酶的应用放射性探针的标记DNA 标记：类似T4 （取代合成） 末端补平：类似T4聚合酶的两种特殊反应：（1）DNA 第六节核酸修饰酶切口转移与链取代 一. 修饰的 T7 DNA聚合酶DNA切口转移法制备放射性（2） 分子杂交探针 聚合 更高（*3）！ Klenow二、片段 5外切片段Klenow聚合酶的、1DNA 无 3外切 无！修饰的

7、3 5 聚合T7 DNA低聚合酶的应用：合成能力： 外切5 更高、无！更快、更强！标记：重在“掺”与5 3 外切 低 末端补平：（phosphotase）磷酸酶（kinase） & 激酶.二 片段的应用Klenow2. 降解单链核酸（DNA或RNA）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区T4 多核苷酸激酶 （2） S1核酸酶的应用-RNA（1）特点 分子的定位 基因编码；噬菌体pseT来源：T4 2. Bal31核酸酶 Bal31核酸酶的三种活性：-OH 加磷酸；（1）单链核酸内切 （2）T4 kinase 5末端标记的机理 （2）双链核酸外切 （用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使5OH基国暴露，3）双

8、链切口对应链 Bal31分子中转移来的r-P基团键核酸酶主要用途： 同多核苷酸激酶从r-P ATP（1）诱发合，实现末端标记。 DNA发生缺失突变 （2）定位测定DNA（3） T4 多核苷酸激酶的应用 片断中限制性位点的分布 末端标记a: 5（3）研究超盘旋DNA b:末端磷酸化分子的二级结构 3. 其他核酸酶磷酸酶 外切核酸酶（Exonuclease ）（1）特点 ：3至5外切 ，Bacterial Alkaline Phosphotase细菌碱性磷酸酶来源：（RNABAP），E.coli；小牛肠碱性磷酸酶（酶（RNase）：切割DNA-RNA杂合链中的Calf intestinal RNA

9、 ，小牛肠。Alkaline Phosphotase, CIAP） 其他核酸酶:外切核酸酶（ 5-P Exonuclease ）：外切去磷酸 磷酸酶作用机理（2） DNA酶PDNAP5催化核酸分子脱掉，使分子5转（DNase ）：随机切割ss & dsDNA 脱磷酸作用。OH化成5 RNA酶（RNase ）：切割DNA-RNA杂合链中的RNA T4这样产生的和r-PAOH5末端，为随后在TP 多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。第三章（3） 磷酸酶的应用 Techniques 基因工程技术 末端标记前处理Outline 防止分子自身环化DNA1比较与（4） BAPCIAP、电泳 2失活

10、、分子杂交 30min：active CIAPBAP）热稳定性（65 ： 3、转化与转染 4、核酸测序 5、 核酸外切酶第七节 DNA扩增-PCR 6、核酸-蛋白相互作用切酶Exonucleases（核酸外1. ） 第一节定义: 电泳一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核 原理：通过电场的作用使带电的大分子在电泳介质中苷酸的酶。 运动。目的：根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同分类：单链的核酸外切酶 的分子（依据不同的凝胶体系）双链的核酸外切酶 。电泳的分类：第八节核酸内切酶 琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis 核酸酶1. S1）， 特点：（1） 聚丙

11、烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel Agarose与 PAGE的不同：分辨率 PAGEelectrophoresis，） 操作 应用：RFLP, AFLP, DD-PCR, 琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）sequencing, primer extension, S1 mapping, RNase protection assay ds-DNA 的：目 分离不同长度的DNA片段第二节 分子杂交 确定DNA片段的长度 a.一. 分子杂交概述确定b.DNA的有无与多少 （1） 定义c.分析酶切产物 分子杂交（molecularhybrid

12、ization: 凝胶电泳的原理略 ）：不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非电泳步骤 共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术统第一步：制胶 称为分子杂交技术。 第二步：样品制备 （2） 第三步：点样 用途 形成 第四步：跑电泳DNADNA（DNARNA）杂种分子，可以用来 第五步：紫外灯下检测，拍照a.检测特定生物体之间的亲缘关系。 第六步：数据处理 b.揭示核酸片段中某一特定基因的位置。 缓冲体系：TAE, pH 8.0, 50 mM - Tris, Acetate, EDTAc.对目的基因进行相对定量。 d.对特定蛋白质进行定性及定量分析 TBE, pH 8.

13、0, 50 mM - Tris, Borate, EDTA （3） 杂交的基本步骤 以核酸分子杂交为例： 影响迁移率的因素：凝胶电泳分离的DNA/RNA 凝胶的孔径 吸印,转膜 （通过毛细管作用或电导作用电压 ） DNA片段长度及结构探针标记的影响EB 杂交 检测 分辨率影响因素：（4）. 琼脂糖浓度种类 Southern: DNA-DNA 缓冲液或样品的盐离子浓度Northern: DNA-RNA 核酸上样量Western: Pr-Pr 电压 二（. Southern blotting poly-acrylamide gel 泳电胶胺烯聚丙酰凝1. Southern Blotting ）PA

14、GE electrophoresis，（1） 范围：短片段 目的：检测特定DNA序列。分辨率： 1bp （2） 类型：电泳分离DNA，并将之转至尼龙膜上，以标记好的探针（变性胶（长度） 、DNA）与之杂交。 非变性胶（长度、构型）（3） DNA、2、1变性胶：含尿素；步骤 Protocols样品经甲酰胺与热处理；a.、电泳保持温度。3基因组DNA制备 酶切消化b.DNAc.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断RPA有Northern Blot无法比拟的优势：过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应 d.碱变性，中和 更加完全 。到固相支持物e.转移DNA（如，尼龙膜） RPA比Northern Blot灵敏15150倍，适合检测各种表达水平之基因 。f.杂交反应 RPA 通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一放射自显影g.情况下的差异表达。h.数据分析 2. Other DNA analyses一次RPA就能完